刘梓韬，王继坤，王丽，曹庸，郭丽琼，曹素芳，赵力超,2*

1(华南农业大学 食品学院，广东 广州，510642)2(广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东 广州，510640)3(澳优乳业(中国)有限公司，湖南 长沙，410200)

2种真菌漆酶降解桉叶木质素的比较

刘梓韬1，王继坤1，王丽1，曹庸1，郭丽琼1，曹素芳3，赵力超1,2*

1(华南农业大学 食品学院，广东 广州，510642)2(广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东 广州，510640)3(澳优乳业(中国)有限公司，湖南 长沙，410200)

从菌株对桉叶残渣的降解、纯酶与桉叶木质素吸附和降解以及底物和产物变化3个角度，比较研究了木霉LaTr01和灵芝TR6产真菌漆酶降解桉叶木质素的差异。研究结果表明，残渣木质素的降解程度与菌株产漆酶的能力紧密相关，菌株在以桉叶残渣为底物的固态发酵过程中，灵芝TR6产漆酶酶活较高，但木霉LaTr01具有表达量大、胞外分泌率高、产酶速度快等特点；两种纯化真菌漆酶在精制桉叶木质素上的吸附更贴近非均匀表面两阶段多层吸附，符合Sips吸附模型，灵芝TR6被桉叶木质素吸附量较多，酶解效果就更明显；底物光谱分析和产物GC-MS法检测表明，两种漆酶对木质素降解后底物的官能团在种类上没有变化，数量上有一定的差异，降解途径都是侧链氧化去甲基化和芳香环骨架断裂。两真菌漆酶降解桉叶木质素的差异性主要体现分子结构导致的与底物易接近性，从而进一步导致降解酶解率、产物种类和数量的差异。

桉叶木质素；漆酶；木霉；灵芝；酶解差异

桉树(Eucalyptusspp.)为桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)树种的统称，是全球三大著名速生造林树种(桉、松、杨)之一，也是我国华南地区最主要的纸浆用材[1]，我国种植面积已逾200万hm2[2]。桉叶是桉木加工过程中大量存在的副产品，含有桉叶油、黄酮、有机酸、鞣质及酚、蛋白质等有效成分[3-6]。目前对其的利用主要集中在桉叶精油的开发提取上[7]，对其他成分的应用开发研究较少。本课题组前期对桉叶中的多酚种质资源进行了研究[8]，分离提取出抗氧化活性较强的桉叶多酚。经检测，提取精油和桉叶多酚后的桉叶残渣中还含有大量的木质素，如果最终的木质素残渣也能加以利用，就能实现桉叶资源的整体再利用。

目前众多木质素再利用方法中，生物降解法具有处理成本低、条件温和、对环境无污染等优点，是具有应用潜力的一种方法[9]。在自然界中，木质素完全降解需要真菌、细菌和其他微生物群落共同作用，其中真菌起着主要作用[10]。真菌降解木质素通过分泌木质素降解酶，如漆酶(Laccase)，木质素过氧化物酶(LiP)及锰过氧化物酶(MnP)，并在氧分子的共同作用下完成酶解[11]。其中真菌漆酶作为一种多功能氧化还原酶，能够催化木质素等多种化合物的氧化降解反应[12]，具有更大的实际应用价值。目前漆酶主要用担子菌中的白腐菌生产[13]，但随着研究的深入和应用的需要，其他漆酶高产菌株不断被挖掘。课题组前期筛选出2株产漆酶真菌，1株为灵芝(Ganodermalucidum)TR6，优化后菌株产漆酶最高活性可达11 000 U/L[14]与其他常用漆酶生产菌株(糙皮侧耳类)相比，漆酶活性有了较大幅度提高，同时该菌株具有较高的食药用价值。另1株为华南地区土壤中分离得到的产漆酶的小型丝状真菌，鉴定为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)LaTr01，该菌酶活可达480.556 U/L[15]，比灵芝TR6低，但其具有表达量大、胞外分泌率高、产酶速度快等优点。

虽然漆酶降解木质素的机理已经很清晰，但漆酶对不同的底物的降解能力并不一致，针对桉叶木质素的分解能力尚未见报道，对不同漆酶在同一种底物上的降解差异性研究也不够系统。课题组比较了两种真菌灵芝TR6和木霉LaTr01在桉叶残渣上的生长和利用能力，同时将菌株分泌的漆酶纯化，研究两种真菌漆酶与桉叶木质素的吸附特性和降解特性，并对降解产物的种类和数量进行分析。课题组一方面试图解释真菌漆酶降解木质素的差异性所在，对漆酶降解理论体系提供新的数据，另一方面为推动木质素降解产物工业化生产和桉叶加工废弃物的综合利用打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桉叶残渣，取自课题组利用广林9号桉树叶提取桉叶精油、桉叶多酚后剩余残渣，其中木质素含量为30.15%，纤维素含量为41.09%，半纤维素含量为24.05%；木霉LaTr01号菌株，由课题组研究人员自华南地区的菜地、草地、树木园、湖边淤泥中及湖边枯木堆中筛选获得；灵芝TR6号菌株，由课题组研究人员从热带地区多株木腐真菌中筛选获得。

木霉LaTr01和灵芝TR6产漆酶，由课题组经过盐析、超滤和分级柱层析获得，比活力分别为32.16 U/mg和65.38 U/mg。木霉LaTr01产漆酶表观分子量为69.2 kDa，降解木质素无需诱导剂，最适作用条件为pH5.0、50 ℃；灵芝TR6产漆酶表观分子量为62.6 kDa，0.05 mmol/L ABTS为最佳诱导剂，含诱导剂最适作用条件为pH4.6、50 ℃。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基，北京陆桥技术有限公司；双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)，上海古朵生物科技有限公司；2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，Sigma公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D型超净工作台，苏州智净净化设备有限公司；JY92-2D型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-3010系列紫外可见分光光度计，日本岛津；VERTEX70型傅里叶变换红外光谱仪，德国BRUKE公司；7890A-5975气相质谱连用，安捷伦。

1.3 实验方法

1.3.1 桉叶木质素的提取

将干燥后的桉叶残渣在常温下用二氧六环-水(体积比9∶1)溶剂连续抽提4 h，反复提取3次，使原料中木质素和可溶性物质全部被提取出来。然后在旋转蒸发器中，在真空条件下于40 ℃下将溶剂蒸干，得到粗制二氧六环木质素。所得到的粗木质素按Lundquist 液-液提纯方法进行精制[16-17],该方法得到部分水解的、极少缩合的木质素，可作为结构研究用[18]。

1.3.2 桉叶木质素1H-NMR分析

称取15 mg样品溶于0.5 mL DMSO-d6中，在DRX500型超导核磁共振波谱仪上进行1H-NMR测定。

1.3.3 漆酶活力的测定

参考韩君莉的方法[14]并加以改进。以0.5 mmol/L ABTS作为反应底物，在pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠体系中，加入适量的酶液，50 ℃反应5 min。在紫外分光光度计测定420 nm处反映吸光值的变化，取其线性部分，计算漆酶的酶活力。定义每分钟转化1 μmol的底物所需的酶量为1个酶活力单位。

1.3.4 两菌株对桉叶残渣的降解差异

称取一定量100目桉叶残渣，加入无机盐营养液(其中Cu2+为1.0 mmol/L)使其充分湿润，灭菌后接入菌株(灵芝TR6体系额外添加诱导剂ABTS 0.05 mmol/L)。在温度为36 ℃、湿度为80%条件下培养，每隔一段时间测残渣中木质素的量和单位残渣中漆酶的活力。降解率D渣%按公式(1)计算：

(1)

式中：D渣%为桉叶残渣中木质素降解率；M0为桉叶残渣中初始木质素的质量分数；M1为降解一段时间后桉叶残渣中木质素的质量分数。

1.3.5 两种漆酶在桉叶木质素上的吸附及降解差异

1.3.5.1 漆酶的吸附动力学

参考赵力超的方法并加以改进[19]。取1 g精制的桉叶木质素，加入100 mL pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浸没，在4 ℃的冰箱中放置12 h，使木质素充分润胀，达到最大表面积。分组加入过量的等蛋白质质量(20 mg)的两种纯化漆酶(灵芝TR6漆酶反应体系含诱导剂ABTS 0.05 mmol/L)。在4 ℃，转速为150 r/min下吸附，测定不同时间(0、5、10、20、30、60、120、180 min)体系中上清液酶活。空白同上操作，不加吸附剂。吸附量按公式(2)计算：

(2)

式中：Γ，单位底物对酶蛋白的吸附量， mg/g；C0、C1分别是吸附前后酶液的酶活， U/mL；V为体系总体积，mL；m，体系中固体桉叶木质素质量，g；v，所取酶液的体积，mL；SA为酶的比活力，U/mg。

1.3.5.2 漆酶的吸附等温线及等温线模型

操作步骤同上，根据吸附动力学结果设定等温吸附时间，测定不同加酶量(1、2、4、6、8、10、12、16、20 mg)体系中上清液酶活。吸附量按公式(2)计算。绘制吸附等温线，根据吸附等温线的形状和数据，用Freundlich吸附模型(3)、Langmuir单层吸附模型(4)和Sips吸附模型(Langmuir模型改进型)(5)对实验数据进行拟合。数据采用Origin软件处理。

(3)

(4)

(5)

式中：Γe平衡吸附量，mg/g；Γmax为饱和吸附量，mg/g；Ce为单位酶质量浓度，mg/L；b，吸附作用平衡常数；n，吸附剂的不均一性。

1.3.5.3 漆酶的酶解动力学

参考赵力超的方法并加以改进[19]。用100 mL pH4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系浸泡1 g精制的桉叶木质素，在4 ℃的冰箱中放置12 h，使桉叶木质素充分润胀，达到最大表面积。加入15 mg纯化漆酶(灵芝TR6漆酶体系含诱导剂ABTS 0.05 mmol/L)。在50 ℃、转速150 r/min条件下反应一定时间(0、10、20、30、60、100、140、180 min)，研究反应时间对降解率的影响。反应前后在280 nm下测定吸光值，木质素的降解率D木%按照公式(6)计算：

(6)

式中：D木%，精制桉叶木质素的降解率；A0、A1分别为降解前后精制桉叶木质素的吸光值。

1.3.5.4 酶解前后桉叶木质素红外光谱

取1 mg酶解180 min后的样品和100 mg KBr在干燥条件下混合均匀后研磨、压片，在德国BRUKER VERTEX 70型傅里叶变换红外光谱仪上进行测试。扫描范围：4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.5.5 酶解前后体系生成物分析

酶解产物用GC-MS法分析[20]。GC分析采用一级程序升温，45 ℃停留4 min以3 ℃/min升温至280 ℃，保持15 min进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃，载气为氦气，流量1.0 mL/min，分流比为100∶1。MS测试电离源的电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，扫描范围为15～500 u。利用仪器配套的分析软件和NIST02质谱库及人工分析产物的组成并鉴定结构。

2 结果与分析

2.1 桉叶木质素1H-NMR分析

图1 桉叶木质素的1H-NMRFig.1 1H-NMR spectra acquired of Eucalyptus leaves lignin

表1 桉叶木质素的1H-NMR峰谱主要归属Table 1 The assignments of Eucalyptus leaves lignin main1H-NMR absorption peaks

2.2 两菌株对桉叶残渣的降解差异

课题组利用自主研发的低温连续相变萃取技术[19]，以广林9号桉树叶为原料，提取桉叶精油、桉叶多酚[21]，以提取后剩余的残渣为底物，研究木霉LaTr01和灵芝TR6在固态发酵过程中的产漆酶规律和对底物中木质素的降解规律，如图2所示。

从产漆酶能力比较2种菌株(图2右Y轴)：在木质素含量30%左右的桉叶残渣固体发酵培养基上，木霉LaTr01产漆酶的速度明显快于灵芝TR6，在8 d达到峰值，灵芝TR6在21 d才达到峰值。但灵芝TR6的最大漆酶酶活为木霉LaTr01的1倍，能达到60 U/g。从对桉叶残渣的降解比较2种菌株(图2左Y轴)：木霉LaTr01在8 d内分解木质素较快，此后降解速度趋缓，最大分解率为18.5%；灵芝TR6在16 d内的降解速度较慢，在16～24 d内快速上升，此后缓慢增加，最大分解率为31.3%。2菌株对桉叶残渣的降解快慢和降解率高低与菌株产酶规律基本一致。

图2 两菌株产漆酶和降解木质素随时间变化规律Fig.2 The variation of Laccase production and lignin degradation with time in two strains

2.3 两种漆酶在桉叶木质素上的吸附等温线

图3为4 ℃下，木霉LaTr01和灵芝TR6产漆酶(已纯化，比活力分别为32.16 U/mg和65.38 U/mg)在精制桉叶木质素上的吸附动力学实验结果。

图3 在4 ℃下，木霉LaTr01和灵芝TR6产漆酶在精制桉叶木质素上的吸附动力学Fig.3 Adsorption dynamics of LaTr01 and TR6 on refined Eucalyptus leaves lignin at 4 ℃

由图3可见，两种漆酶在精制桉叶木质素上都能很快达到吸附平衡，均在40 min左右。在吸附体系中，纯酶在溶液和单一吸附剂表面之间平衡分布是固定的，由吸附动力学结果可以设定酶的等温吸附实验时间为45 min。

图4 在4 ℃下，木霉LaTr01和灵芝TR6产漆酶在精制桉叶木质素上吸附45 min时的吸附等温线Fig.4 Adsorption isotherms of LaTr01 and TR6 on refined Eucalyptus leaves lignin for 45 min at 4 ℃

由图4可知，4 ℃吸附45 min条件下，两条吸附等温线均符合“S”型吸附等温线特征。当平衡液酶量较小时，吸附量随着平衡液酶量的增加而缓慢增大；当平衡液酶量继续增加，吸附量会急剧增加；当平衡液酶量达到某一值时，吸附量增加开始变缓。桉叶木质素对灵芝TR6产漆酶吸附量较高。

2.4 两种漆酶与桉叶木质素间的等温线模型

根据图3等温线形态，“S”型特征首先排除Freundlich吸附模型，用Origin软件对数据进行Langmuir和Sips吸附模型拟合，结果如表2所示。从R2来看，Sips吸附模型比Langmuir单分子层吸附模型更符合试验结果，按该模型绘制的回归曲线见图4中的实线。

表2 按照公式(4)和公式(5)计算的吸附等温线模拟参数Table 2 Simulation parameters of the adsorption isotherms calculated from the formula(4) and the formula(5)

2.5 两种真菌漆酶对桉叶木质素的酶解差异

两种真菌漆酶对桉叶木质素降解率随时间变化的曲线如图5所示。在前80 min内，降解率随着时间的增加而迅速升高，随后变缓。灵芝TR6漆酶对木质素的降解率较高，最后稳定在33.98%左右，木霉LaTr01漆酶降解率稳定在22.99%左右。

图5 木霉LaTr01和灵芝TR6产漆酶在精制桉叶木质素上的酶解动力学Fig.5 Enzymolysis kinetics of LaTr01 and TR6 on refined Eucalyptus leaves lignin

EL1:桉叶木质素； EL2:LaTr01酶解后的桉叶木质素；EL3:TR6酶解后的桉叶木质素图6 红外光谱图Fig.6 IR Spectrum

表3 主要红外吸收谱带归属Table 3 The assignments of main IR absorption peaks

在24 h条件下比较2种真菌漆酶对桉叶木质素降解的差异，GC-M分析结果见表4。从表4可以看出，空白组出现1,2,3-丙三羧酸及少量的丙酸、十八酸、棕榈酸等物质，与文献中报道的情况吻合，表明木质素确实发生了降解。HERNANDEZ等[22-23]研究发现在木质素的对照组出现小分子的醛类和酸类物质，认为是木质素被空气中的氧气氧化所致。灵芝TR6降解桉叶木质素的产物中含量较高的是丙酸和丙二酸，分别为12.33%和19.67%，丙二酸、乙酰乙酸、丁二酸、丁酸、十四烷酸、L-脯氨酸等都是新生成的物质；木霉LaTr01降解桉叶木质素的产物中出现了丙二酸、丁二酸等新物质，丙酸含量略有增加，其余成分变化不大。

表4 木霉LaTr01和灵芝TR6产漆酶桉叶木质素的产物GC-MS检测结果Table 4 Analysis results of Eucalyptus leaves Lignin after enzymatic hydrolysis by LaTr01 and TR6 by GC-MS

3 结论

(1)两种产漆酶菌株在桉叶残渣上的固体发酵试验表明，虽然菌株在发酵过程中均会产生含漆酶在内的复杂酶系，但二者对底物的利用都依赖于漆酶的分泌，残渣木质素的降解程度与菌株产漆酶的能力紧密相关。同时，该结果验证了课题组前期液体发酵的结果，两菌株产酶各有优点，灵芝TR6产漆酶酶活较高，但木霉LaTr01具有表达量大、胞外分泌率高、产酶速度快等优点。

(2)实验构建的等温吸附体系是异类的固液体系，由水不溶性木质素和水溶性漆酶组成。提纯的桉叶木质素(吸附剂)对不同菌种产漆酶的吸附量不同，说明酶与底物的易接近性不同。漆酶对木质素的易接近性受许多因素影响，如木质素的表面积、密度、孔隙率、孔径大小，酶的分子大小、结构、基团等。木质素是由苯基丙烷结构单元通过碳-碳和醚键连接而成的具有三度空间的高分子聚合物，易形成氢键，憎水基多，不易与水形成氢键，而对两菌株产漆酶吸附量都比较大。两种漆酶的分子量接近，木霉LaTr01产漆酶为69.2 kDa，灵芝TR6产漆酶为62.6 kDa。而漆酶是一种糖蛋白，肽链一般由500个左右的氨基酸组成，糖基占整个分子的10%～45%[24]，糖基的差异导致同工酶的产生[25]。因此，推测实验中的等温吸附差异是由溶液中漆酶的结构状态和糖基的变化造成，原因有待于对两种漆酶的结构进一步研究。

(3)漆酶在木质素上的吸附是一个极其复杂的过程，清楚地认识酶在溶液中的固体上吸附机理存在一定的困难，但可以借助数学模型从理论上进行剖析。实验中Sips吸附模型更符合两种漆酶在木质素上的吸附特性，该模型是Langmuir单分子层吸附模型的变型，是一种非均匀表面两阶段吸附热力学模型。这说明，两种真菌漆酶在木质素上的吸附不是简单的单分子层吸附，更贴近非均匀表面两阶段多层吸附。该模型的建立可对指导设计生化反应器提供参数依据。

(4)酶解动力学和GC-MS结果都说明，对同一种底物来说，吸附酶量越大，酶解率越高。灵芝TR6被桉叶木质素吸附量较多，酶解效果就更明显。GC-MS同样检测到的丙酸、丁酸等小分子酸类物质，可以说明木质素芳香环骨架发生断裂后，被氧化生成羧酸类或者醛类物质[26]。两种漆酶对木质素降解后底物的官能团在种类上没有变化，数量上有一定的差异，降解途径都是侧链氧化去甲基化和芳香环骨架断裂，进而说明了不同来源的漆酶作用在木质素的位点是相同的，但程度不同。

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ComparativestudyonEucalyptusleaveslignindegradationbytwofungallaccase

LIU Zi-tao, WANG Ji-kun1, WANG Li1, CAO Yong1,GUO Li-qiong1, CAO Su-fang3, Zhao Li-chao1,2*

1(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)2(Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, Guangzhou 510640, China)3(Ausnutria Dairy (China) Co. Ltd., Changsha 410005, China)

TheEucalyptusleaves lignin degradation byTrichodermaspp. LaTr01 andGanodermalucidumTR6 from three aspects the degradation ofEucalyptusleaves, the adsorption and degradation of pure enzyme andEucalyptuslignin, and the changes of substrate and product. The results prove that the degradation degree of residual lignin was closely related to the laccase producing ability. In the process of solid-state fermentation withEucalyptusleaves residue as substrate, the laccase activity of TR6 was higher, LaTr01 showed the characteristics of high expression, high excretion rate and rapid enzyme production. The adsorption of two kinds of purified laccase on purifiedEucalyptuslignin was close to the Uniform Surface Two-Step Adsorption Model, which conformed to Sips adsorption model adsorption capacity of TR6 was higher and the effect was more obvious. Spectroscopic analysis of the substrate and detection of the product by GC-MS showed that there was no difference in the number of functional groups in the substrates of the two kinds of laccase, the degradation pathway of both the side chain oxidative demethylation and the aromatic ring skeleton breakage. The differences of the degradation ofEucalyptusleaves lignin by two kinds of fungal laccase mainly showed that the molecular structure of laccase led to the accessibility of the substrate, which further led to the enzymatic hydrolysis rate the type and quantity of products.

Eucalyptusleaves lignin; laccase;Trichoderma;Ganodermalucidum; difference of enzymatic hydrolysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014223

硕士研究生(赵力超副教授为通讯作者,E-mail：zlc@scau.edu.cn)。

广东省科技计划项目(2013B090800022)；广东省科技计划项目(2017A020224024)；广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室开放基金资助项目(201613)

2017-03-06，改回日期：2017-07-12