李 硕，白 玉，薛 蓓，娄海华，杨秀航，董 逸，赖晓芳,2,3，阎斌伦,2,3，高 焕,2,3

( 1．淮海工学院 海洋学院，江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005； 2.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222001； 3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014 )

脊尾白虾腺苷酸转移酶基因应答蜕皮的表达特征研究

李 硕1，白 玉1，薛 蓓1，娄海华1，杨秀航1，董 逸1，赖晓芳1,2,3，阎斌伦1,2,3，高 焕1,2,3

( 1．淮海工学院 海洋学院，江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005； 2.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222001； 3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014 )

蜕皮是脊尾白虾等甲壳类生物的一种特殊生活史，在前期克隆获得腺苷酸转移酶基因的基础上，研究了该基因在脊尾白虾蜕皮后不同组织和不同时间点(0、1、5、10、15 min)的表达特征。试验结果表明，蜕皮后鳃组织中腺苷酸转移酶基因的表达量显著上升(P<0.01)；在蜕皮后1 min，腺苷酸转移酶基因的表达量开始升高，至10 min时达到峰值，随后下降。该结果显示，腺苷酸转移酶基因的表达特征与脊尾白虾蜕皮时的行为学特征一致，说明腺苷酸转移酶基因在甲壳动物蜕皮过程中起着非常重要的作用。

脊尾白虾；腺苷酸转移酶；蜕皮；表达特征；基因

腺苷酸转移酶(ANT)作为真核细胞的转运蛋白家族成员，是线粒体中最丰富的蛋白质之一，约占细胞线粒体内膜总蛋白的1%～10%[1-3]。腺苷酸转移酶蛋白酶的生物学功能主要是作为重要代谢物的载体参与线粒体的各种生理活动，将线粒体内合成的三磷酸腺苷转运至胞浆供能，并将胞浆二磷酸腺苷转入线粒体内通过氧化磷酸化产能[1]。生物体内大约1/2～1/3的基础电子传递由腺苷酸转移酶催化，因此腺苷酸转移酶是保持细胞内能量代谢的关键成分[4]。

目前甲壳类生物中，该基因的功能已经受到广泛的关注，如在旧金山湾卤虫(Artemiafranciscana)胚胎中的腺苷酸转移酶蛋白酶与钙离子运输密切相关[5]；在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中腺苷酸转移酶基因表达变化与低温胁迫有关[6-7]。笔者也克隆了脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)腺苷酸转移酶基因(GenBank号：KP892663)，并探讨了该基因在不同发育期的表达特征(另文发表)，但该基因如何响应蜕皮这一生理活动的表达特征一直未见相关报道，而这对于揭示甲壳类蜕皮过程中的分子调控机理又具有重要的意义。

脊尾白虾作为一种重要的经济虾类，不仅其养殖生物学日益受到关注[8]，而关于其作为海洋虾类模式生物研究的优点也受到肯定[9]，如具有生长速度快、繁殖率高、环境适应性广等特点[10]，因此以此虾为试验材料的文献越来越多。本文以脊尾白虾为试验材料，通过对其蜕皮后至恢复正常状态这一过程中不同时间点腺苷酸转移酶基因表达特征的研究，以期为揭示甲壳类蜕皮过程中的能量传递相关基因的调控特征提供指导帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用脊尾白虾取自一个养殖池塘自繁的“半成年”个体(比成年个体具有更快的蜕皮生长潜力)，选取体长(3.19±0.39) cm、体质量(1.12±0.40) g、健康无病的个体，每两尾个体作为一组放入28 cm×18 cm×20 cm的透明水族箱中进行养殖，每日早晚各投喂1次，利用虹吸法吸底层排泄物1次。养殖盐度26，pH 8.1±0.2，平均水温24 ℃。

1.2 蜕皮行为观察及取样

全天24 h不间断观察各养殖水箱中脊尾白虾活动状况；查明脊尾白虾蜕皮活动规律后，分别在蜕皮后的第0(对照)、1、5、10、15 min点取样，每个时间点各取3次(3次重复)。同时以同一养殖水箱中与蜕皮个体共同养殖的未发生蜕皮的脊尾白虾个体作为对照。取样后，立即放入冰箱中-80 ℃保存待用。

1.3 RNA提取及cDNA第一链合成。

根据试剂盒说明，利用Trizol试剂(Invitrogen)提取各个时间点各虾肌肉组织中的总RNA，同时为了考察蜕皮后腺苷酸转移酶基因在组织间的表达是否存在差异，在蜕皮1 min时，分别提取肌肉、胃、鳃和眼柄4个组织中的总RNA，利用不含有RNA酶的DNaseI处理RNA以去除可能存有的DNA后，再利用反转录酶[M-MLV reverse transcriptase (BBI)]以T7d(T)12(引物序列见表1)为引物合成cDNA第一链。

1.4 Real-time PCR分析

针对脊尾白虾ANT基因的cDNA序列，设计了一对用于实时定量PCR分析的引物(引物序列见表1)，同时以18S rRNA基因作为内参基因(引物序列见表1)，通过实时定量PCR技术对各个蜕皮时期的脊尾白虾个体的ANT基因表达情况进行相对定量分析。荧光实时定量PCR采用20 μL扩增体系，反应体系各成分终浓度为：1×SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ、正反向引物量各为400 nmol/L、1×ROX Reference Dye、40 ng cDNA。采用StepOnePlusTM型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems Inc.)进行扩增，扩增程序为：先95 ℃变性30 s,再95 ℃变性5 s，60 ℃复性31 s进行40个循环，最后是一个熔解曲线程序(95 ℃进行15 s， 60 ℃进行60 s，再95 ℃ 15 s)。

表1 本研究中所使用的引物序列

1.5 数据分析

采用比较Ct法对获得的定量结果进行分析，利用T检验对不同时间点脱壳后与对照组间的腺苷酸转移酶基因表达量进行差异分析。

2 结 果

2.1 脊尾白虾蜕皮的行为学观察

正常情况下，脊尾白虾腹部体色透明；将要蜕皮的脊尾白虾腹部微发白，不再透明，小斑点明显；蜕皮后，虾通体轻微发红。投喂时，正常虾行为活跃，争抢饵料；而将要蜕皮虾不活跃，不进食。另外，大部分将要蜕皮虾在蜕皮前活动不积极，远离虾群，单独静卧在水族箱角落。

在脊尾白虾尝试蜕皮间隔期间，少数虾静伏不动，多数虾会四处游走，并且伴随着抖头、抖尾、身体翻转倒游和身体斜侧运动等行为。将要蜕皮时，其腹部向内收，呈弓形蜷缩状，游泳足和步足靠在一起。此时，任何打扰(其他虾的靠近、外界响声、震动、光照等)都会造成其立即放弃蜕皮，腹部伸展回正常状态。在无打扰情况下，脊尾白虾在5～10 min尝试蜕皮3～5次。若未蜕皮成功，1～1.5 h后脊尾白虾将再次尝试蜕皮。

脊尾白虾蜕皮活跃时间点为0:00～6:00。蜕皮时，脊尾白虾自胸和腹部相接处蜕出，此过程约3～5 min，随后蜕皮个体开始逐渐恢复活动能力，而蜕皮10 min后个体已经从外观上完全恢复正常。

2.2 蜕皮后不同组织表达特征差异

选取脊尾白虾蜕皮前(对照)和蜕皮后(蜕皮后1 min)的肌肉、眼柄、鳃和胃4种组织，研究了腺苷酸转移酶基因在这些组织中的表达量变化(图1)，结果表明，腺苷酸转移酶基因在鳃组织中的表达量变化最大，与蜕皮前相比，其表达量提高了约1000倍，与其他组织相比差异极显著(P<0.01)，而在其他组织中蜕皮前后的表达量变化不大，不存在统计学上的显著性差异(P>0.05)。按照表达丰度的大小，腺苷酸转移酶基因表达量在4种组织中的顺序为：鳃>肌肉>眼柄>胃。

图1 蜕皮前后腺苷酸转移酶基因在不同组织中的表达量变化

2.2 蜕皮后不同时间点的表达特征

蜕皮后第0、1、5、10、15 min时间点脊尾白虾肌肉组织中的腺苷酸转移酶基因表达特征见图2。在蜕皮后1 min，腺苷酸转移酶基因表达量开始上升，在第10 min时达到峰值(与对照相比，表达量增加了844倍)，随后开始下降，在第15 min时表达量与第1 min时的表达量已经近似。T检验表明，在第1、5、10、15 min时，蜕皮个体肌肉组织中的腺苷酸转移酶基因表达量与对照组相比均存在统计学上的显著性差异(P<0.05)。

图2 蜕皮前后腺苷酸转移酶基因在不同时间点的表达量变化

3 讨 论

蜕皮是甲壳类动物在生长发育过程中不断通过蜕掉外骨骼而进行生长的一种特殊生活史特征，是一个内在生理反应和外在环境相协调的过程[11]。已有研究表明，温度、盐度和pH值均能显著影响对虾的蜕皮和生长，如对于印度明对虾(Fenneropenaeusindicus)而言，只有最佳的环境条件才能让蜕皮次数和生长达到同步的增长[12]。本研究中为尽快获得不同蜕皮时间点下的个体，采用了生长状况良好、蜕皮能力强的“半成年”个体，同时将盐度、温度和pH等环境因素均设置在脊尾白虾生长状况最适条件。对脊尾白虾蜕皮过程的观察表明，脊尾白虾在蜕皮过程中保持着较高的警惕性，任何意外的碰触都可能导致其终止蜕皮过程。这可能是因为脊尾白虾蜕皮过程中自我保护力最弱，身体柔软，极易受到同类及其他敌害生物的残食[13]，因此只有找到一个最安全的空间和时间才发生蜕皮活动，这也是动物长期进化过程中形成的一种保护机制。

甲壳动物的蜕皮过程主要是由蜕皮抑制激素和蜕皮激素相互拮抗进行调控的[14]，除此之外，还有很多遗传因子参与蜕皮的过程，如钙调蛋白基因[15]、法尼酸甲基转移酶基因[16]等。但是对这些基因表达特征的分析主要集中在一个完整蜕皮周期循环上，如蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期和蜕皮期[17]，而对于蜕皮后至恢复正常状态这一短期(约10 min)过程中不同时间点上能量传递相关基因的表达特征还不清楚。已知蜕皮过程在宏观上与生态能学(温度)有关[18]，本研究则从基因表达角度阐释了这一过程与能量传递相关基因表达的关系。在刚蜕皮后(1 min)，与能量传递相关的腺苷酸转移酶基因表达水平开始升高，至10 min左右达到峰值，随后开始下降。这一腺苷酸转移酶基因表达特征与实际观察的蜕皮行为吻合：蜕皮后，脊尾白虾需要大量能量来恢复身体的“损伤”，所以蜕皮后腺苷酸转移酶基因表达量开始上升，而在蜕皮后约10 min时蜕皮个体完全恢复正常，此时腺苷酸转移酶基因的表达量也最大，随后随着机体恢复正常，腺苷酸转移酶基因表达量又开始下降。由此可见，腺苷酸转移酶基因在蜕皮过程中起着非常重要的作用。

不同基因在不同组织中的表达量是存在差别的，这主要与该基因的作用有关[19]。在本研究中，蜕皮后腺苷酸转移酶基因主要在鳃中表达，其表达量是其他组织的几百倍，这可能与鳃是脊尾白虾的呼吸器官有关。作为脊尾白虾的呼吸器官，虽然蜕皮时其他器官都几乎静止不动，但是鳃却需要不停的摆动以获得充足的氧气来维持机体的生命功能，因此鳃此时是机体蜕皮时能量需求最旺盛的器官，而腺苷酸转移酶基因的表达是与能量产生和传递相关的，也就不难理解腺苷酸转移酶基因为何在此器官中表达量如此之高了。

[1] Santamaria M，Lanave C，Saccone C．The evolution of the adenine nucleotide translocase family [J]. Gene, 2004, 333(25):51-59．

[2] Bof M，Brandolin G, Satre M, et al. The mitochondrial adenine nucleotide translocator fromDictyosteliumdiscoideum, functional characterization and DNA sequencing [J]. Eur J Biochem, 1999, 259(3): 795-800．

[3] Martin D B，Julian L P, Augustine O，et al. The basal proton conductance of mitochondria depends on adenine nucleotide translocase content [J]．Biochem J, 2005, 392(Pt2):353-362．

[4] Brustovetsky N，Klingenberg M．Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large channel by Ca2+[J]．Biochemistry, 1996, 35(26)：8483-8488．

[5] Konràd C, Kiss G, Töröcsik B, et al. A distinct sequence in the adenine nucleotide translocase fromArtemiafranciscanaembryos is associated with insensitivity to bongkrekate and atypical effects of adenine nucleotides on Ca2+uptake and sequestration[J]. FEBS Journal, 2011, 278(5):822-836.

[6] 殷勤，崔亮，彭金霞，等．凡纳滨对虾ANT2基因的克隆及低温表达谱分析[J]．水生生物学报，2012，36(1)：24-28．

[7] 于坤，叶海辉，巩杰，等. 拟穴青蟹ANT2基因的克隆与低温胁迫表达分析[J]. 厦门大学学报：自然科学版, 2014, 53(3):436-442.

[8] 梁俊平, 李健, 刘萍, 等. 脊尾白虾生物学特性与人工繁育的研究进展[J]. 中国农学通报, 2012, 28(17):109-116.

[9] Zhang J, Wang J, Gui T, et al. A copper-induced metallothionein gene fromExopalaemoncarinicaudaand its response to heavy metal ions[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 70(8): 246-250.

[10] 王兴强，阎斌伦，马甡，等. 脊尾白虾生物学及养殖生态学研究进展[J]. 齐鲁渔业, 2005, 22(8):21-23.

[11] Cesar J R O, Yang J. Expression patterns of ubiquitin, heat shock protein 70, α-actin and β-actin over the molt cycle in the abdominal muscle of marine shrimpLitopenaeusvannamei[J]. Molecular Reproduction and Development, 2007, 74(5):554-559.

[12] Vijayan K K, Diwan A D. Influence of temperature, salinity, pH and light on molting and growth in the Indian white prawnPenaeusindicus(Crustacea: Decapoda: Penaeidae) under laboratory conditions[J]. Asian Fisheries Science, 1995(8):63-72.

[13] 姜令绪, 王仁杰, 周莉, 等. 脊尾白虾在不同盐度条件下的行为变化[J]. 南方农业学报, 2011, 42(12): 1564-1567.

[14] 张美, 刘萍, 李吉涛, 等. 脊尾白虾蜕皮抑制激素基因全长cDNA 的克隆及其对环境胁迫的响应[J].海洋与湖沼, 2015, 46(4):764-774.

[15] 张龙涛, 吕建建, 高保全, 等. 三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析[J]. 中国水产科学, 2015, 22(6):1150-1159.

[16] 谢熙, 朱冬发, 崔晓雨, 等．三疣梭子蟹FAMeT基因克隆及其在蜕皮周期中的表达水平[J]. 水产学报, 2013, 37(7):994-1001.

[17] Skinner D M. The structure and metabolism of a crustacean integumentary tissue during a molt cycle [J]. Biological Bulletin, 1962, 123(3):635-647.

[18] 朱小明, 李少菁. 生态能学与虾蟹幼体培育[J]. 中国水产科学, 1998, 5(3):104-107.

[19] Duan Y F, Liu P, Li J T, et al. Expression profiles of selenium dependent glutathione peroxidase and glutathione S-transferase fromExopalaemoncarinicaudain response toVibrioanguillarumand WSSV challenge [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 35 (3): 661-670.

ExpressionProfilesofANTinResponsetoDifferentTimeafterPost-moltinginRidgetailWhitePrawnExopalaemoncarinicauda

LI Shuo1, BAI Yu1, XUE Bei1, LOU Haihua1, YANG Xiuhang1, DONG Yi1, LAI Xiaofang1,2,3, YAN Binlun1,2,3, GAO Huan1,2,3

( 1.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China;2.Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology, Lianyungang 222005, China;3.The Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014, China )

As one of the mitochondrial proteins, the adenine nucleotide translocase (ANT) facilitates the exchange of ADP and ATP across the mitochondrial inner membrane, and plays an essential role in cellular energy metabolism. In our previous studies, a gene coding adenine nucleotide translocase in the ridgetail white prawnExopalaemoncarinicaudawas cloned. Here, the profiles of ANT expression in different tissues and 0, 1, 5, 10 and 15 min after molting were analyzed in order to explore how the ANT takes part in the molting. The results showed that the expression level of ANT was increased dramatically in gills, significantly different from the control (P<0.01). Additionally, the expression level was tended to increase at initial molting stage, then decrease after obtaining a summit at the 10th minute. The expression profiles was consistent with the molting procedure observed in our previous study. The findings suggest that the ANT plays an important role in the process of molting for ridgetail white prawn.

Exopalaemoncarinicauda; adenine nucleotide translocase (ANT); molt; expression profile; gene

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.020

2016-04-19；

2016-06-29.

2015年度江苏省大学生实践创新训练计划项目(5509005)；水产类重点专业建设项目(ZD2014001)；江苏省农业科技支撑计划(BE2013363)；江苏省高校“青蓝工程”培养基金、连云港市产学研合作项目(CXY1517)；淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室研究基金资助项目(2015HS001).

李硕(1995-)，男，本科生；研究方向：海洋生物学. E-mail:shiyeyishang@sina.com. 通讯作者： 高焕(1976-)，男，副教授；研究方向：海洋甲壳类遗传学. E-mail: huanmr@163.com.

S917

A

1003-1111(2017)02-0224-04