杨辉

【摘 要】目的探究基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪在临床微生物鉴定中的应用，为真菌微生物的鉴定提供临床技术支持。方法选取于2015年3月到2017年2月我院临床采集的真菌作为实验标本，利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪对菌种进行鉴定，分析基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪对菌种鉴定的检查效果。结果300株真菌中有290株（96.67%）经鉴定后可以正确归类到种水平，6株（2%）未能给出鉴定成果，4株（1.33%）鉴定结果出现错误，且正确率与传统方法相比差异显著，具有统计学意义（P<0.05）。结论基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪稳定性高，可重复性好，并且具有快速准确的优点，是临床鉴定微生物种类的一种快速可靠的高通量方法，可以为临床的微生物鉴定提供一定的技术支持。

【关键词】基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪；微生物鉴定；临床应用

真菌感染是指由于机体感染真菌而引起的一系列疾病，感染类型大致包括表面感染，皮肤感染，皮下组织感染，深部感染以及条件性感染[1-4]。發生真菌感染的原因有很多，主要包括以下五个方面：（1）滥用抗生素：随着光谱抗生素的广泛应用，越来越多的人们选择利用抗生素来治疗细菌感染，这些抗生素在治疗感染的同时也会减少有益菌的数量，从而破坏机体菌种平衡。（2）糖皮质激素的过量使用：针对炎症患者以及皮肤病患者糖皮质激素的使用是必不可少的，然而这些药物的使用却会导致人体的免疫系统功能下降，为真菌感染创造了有利条件。（3）遗传因素：遗传因素也是机体产生真菌感染的一个重要原因，相对于正常人，这类人群由于遗传物质的差异性导致他们更容易受到真菌的侵袭。（4）免疫系统功能障碍：由于化疗或者免疫系统缺陷症等因素导致机体免疫系统功能发生障碍，从而给真菌染感染创造了一个适宜生长的环境[5-9]。因此真菌感染在临床上也越来越多见。常见的实验室真菌鉴定方法是常规传统真菌鉴定方法，这种方法操作复杂，鉴定周期较长，对于设备以及技术水平的要求较高，因此往往会造成临床诊断以及治疗的滞后性，会广大医患人员带来较大的困扰，然而随着科学技术的不断进步，基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术出现在人们视野之中。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术是一种快速鉴定微生物种类的新技术，近年来广泛应用于医学、生物等多个领域[10]。因此本次研究通过比较传统真菌鉴定方法与基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术对菌种鉴定的准确率，探究基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪在临床微生物鉴定上的应用。

1 资料与方法

1.1 菌种来源

本次研究一共选取300株真菌作为研究对象，全部菌株均来自于2015年3月到2017年2月我院临床采集的真菌，质控菌种为白念珠菌ATCC14053和大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 试验仪器与设备

法国梅里埃公司的基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪以及配套的数据库系统，电子显微镜，水浴锅，无菌注射器，基质液，一次性无菌试管，全自动微生物鉴定仪，真菌培养箱，离心机，移液枪等。

1.3 实验方法

对采集来的真菌标本进行分离培养，标本接种在平板上在36℃的真菌培养箱中进行培养，直到肉眼可见菌落时进行细菌种类鉴定。对所有菌种同时采用两种方法进行鉴定，分别为常规传统真菌鉴定方法以及基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术，对比两种结果准确率。常规真菌鉴定方法是将菌落进行革兰氏染色，同时对菌落进行镜检，通过对菌落的形态以及革兰氏染色结果进行分析。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法是将真菌接种到靶板上，然后再菌膜没有完全干燥之前加入α-腈基-4-羟基肉桂酸基质，等待基质和菌株混合物完全干燥后将样本放入仪器中进行分析扫描，利用数据库进行鉴定，判断菌株种类。结果结果可信程度在60.0%-99.9%之间且结果为一个是认为该结果可以接受。

1.4 统计学分析

所有数据均采用统计学软件SPSS19.0进行统计分析，计量资料采用百分比表示，进行卡方检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 真菌鉴定种类分布

经过鉴定，300株真菌种类分别为：热带念珠菌、白色念珠菌、阿萨斯酵母菌、烟曲霉米曲霉、宛氏拟青霉、烟草赤星病菌，详细数据见下表。

2.2 两种方法鉴定真菌的正确率比较

本次研究采用了两种真菌鉴定方法，常规鉴定组共检查300株真菌，其中正确的有156株，正确率为52.00%，100例检查错误，44例未检出；基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术共检查300株真菌，其中290株检查正确，正确率为96.67%， 6株（2%）未能给出鉴定成果，4株（1.33%）鉴定结果出现错误。两组检查方法正确率存在差异，基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术检查正确率远高于常规鉴定组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。详细数据见表2

3 讨论

基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术是近年来出现的一种软电离新型有机质谱，这种新的技术手段已经广泛应用于生物、医学行业，是检测和鉴定多肽大分子物质以及蛋白质的有效手段，具有十分高的灵敏度，并且检测的准确率高，操作简单，检测周期短，稳定性高，是十分方便快捷的技术[11-13]。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术可应用于多个领域，其中基于细菌表面蛋白分子量进行细菌鉴定的技术尤为引人注意。通过将微生物和等量的基质分别点加在加样板上形成混合物，然后利用激光的能量使样品解离，通过计算不同物质飞行时间不同来检测离子分子量，然后应用质谱技术对结果进行处理，生成特异性的蛋白质组指纹图，从而进行对比分析，鉴定微生物种类[14-16]。由于这种检测方法是利用蛋白质图谱来进行的，而每种微生物的蛋白组成受遗传因素的影响，不受外界环境等因素的制约，因此相对于其他的检测手法，这种蛋白质图谱法能更为直观准确的进行微生物的鉴定。endprint

在本次研究中，我们发现新的基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术检查的正确率为96.67%，远远高于传统的检查手法，说明基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术具有准确率高的特点，并且在进行实际的操作实验中，传统的实验方法是基于形态学或生理生化特性进行鉴定，需要的时间较长，且操作繁琐，而且对于一些相似的菌种鉴别过程仍然存在一定的困难；但是利用这种新型技术操作的时间就大大减少，首先进行2-3天的菌株培养，等待菌株生长完成后进行样本的制备，该过程仅需花费不到半个小时，因此时间大大的减少。曾有研究表明[17]，基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术常见的人畜病原菌检测中具有较好的准确率，对于单增李斯特菌、沙门氏菌、肺炎链球菌等病原菌都有十分高的准确率。Phillips等曾经对对来自病人的437个菌株进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱测试，差异结果用16S 基因进行分析，结果发现该方法鉴定菌株的正确率高达95.1%[18]。同时对980 株来自临床的细菌和酵母菌株进行确认，发现基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术鉴定种的正确率（95.34%）明显高于传统的生化鉴定系统（83.1%）。并且，这种新型技术可以直接检测来自医院临床病人的样本，不需要经过纯培养，因此检测时间短，对于患者的临床诊断以及治疗有很大的帮助作用，在急性病原菌感染患者的检测和治疗上均有十分广阔的应用前景[19，20]。

综上所述，基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱技术在微生物鉴定上具有高正确率、高敏感性以及高稳定性，并且操作简单，鉴定周期短，价格低廉，适合在临床上进行推广应用。

【参考文献】

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