朱永乐 董 娜 曲晓兰 齐永秀

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

HPLC法测定不同产地紫草中去氧紫草素的含量

朱永乐 董 娜 曲晓兰 齐永秀

(泰山医学院药学院，山东 泰安 271016)

目的 建立测定不同产地紫草中去氧紫草素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Symmetry C18BDS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为乙腈-水(80∶20)，流速为1.0 ml/min,检测波长265 nm，柱温35℃，进样量20 μl。结果 去氧紫草素在10.00～50.00 μɡ/ml范围内浓度与峰面积线性关系良好(r=0.9994)；去氧紫草素的加样回收率分别为100.17%、112.82%、125.28%(RSD=0.10%,n=9)；山东紫草、安徽紫草、陕西紫草和新疆紫草中的去氧紫草素的百分含量分别为71.40%、67.77%、135.32%。结论 该含量测定方法准确，有效，快速，重现性较好，可用于紫草中的去氧紫草素含量的测定。

去氧紫草素；HPLC法；不同产地；含量测定

紫草，别名有山紫草、地血、鸦衔草、紫草根、紫丹、紫芙等。据《中华人名共和国药典》收载，紫草为紫草科(Boraginaceae)植物紫草(Lithospermum erythrorhizohsieb.et Zuce)、新疆紫草{Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst}和内蒙紫草(Arnebiaguttata Bunge)的干燥根[1]。紫草药材中的萘醌类是主要的有效成分，含量约占3%～6.5%。文献报道在新疆紫草中得到的萘醌类化合物，包括去氧紫草素、紫草素、β- 羟基戊酰紫草素、β-二甲基丙烯酰紫草素、β-羟基异戊酰阿卡宁、乙酰紫草，其中，乙酰紫草醌、紫草醌、去氧紫草素等萘醌类色素为紫草药材的主要有效成分[2-4]。高效液相色谱法为常用的测定方法[5]，本实验采用高效液相色谱法对山东、新疆、安徽三个产地紫草药材的去氧紫草素的含量进行测定，并进行了方法学考察，方法简便，准确，重现性好，灵敏度高。

1 仪器与试剂

1.1仪器

Waterse2695高效液相色谱仪，Waters2998二极管阵列检测器；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；电子天平FR224CN(上海奥豪斯仪器有限公司制造)；电热恒温水浴锅HH.SY11-NY2C(北京市长风仪器仪表公司)；SHB-III循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2材料与试剂

去氧紫草素对照品(上海源叶生物科技有限公司B21034-10MG) ；山东紫草、安徽紫草和新疆紫草(药店购买，经段瑞老师鉴定)；乙腈色谱纯(天津永大试剂有限公司)；甲醇色谱纯(天津永大试剂有限公司)。

2 试验方法与结果

2.1溶液配制

2.1.1对照品溶液的制备 精密称取去氧紫草素的对照品1 mg，置10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1 mg/ml的对照品溶液，置阴凉干燥处，避光环境保存。

2.1.2供试品溶液的制备 将干燥紫草药材粉碎，过60 目筛，精密称取紫草药材粉末1.0 g,置于50 ml的锥形瓶中，加入甲醇25 ml，超声提取30 min，振摇后静置冷却约10 min,滤过，滤渣加20 ml的甲醇，超声提取20 min，合并甲醇滤液并定容至50 ml，置40 ℃恒温水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至25 ml，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，既得供试品溶液。

2.2方法学考察和样品测定

2.2.1色谱条件和系统适应性试验 色谱柱：Symmetry C18BDS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈∶水(80∶20)；流速：1.0 ml/min；检测波长:265 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μl；检测时间：30 min。在此色谱条件下, 去氧紫草素的理论塔板数大于5000,与相邻色谱峰分离度大于1.7,对称因子为1.06。

2.2.2专属性试验 取空白溶液、对照品溶液、三个产地的供试品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图(图1)。由图1可见，空白溶液色谱在对照品色谱相应的位置无吸收峰，表明在该试验条件下其他组分对测定结果无干扰，专属性较好。

图1 紫草样品及去氧紫草素的色谱图

2.2.3线性关系的考察 精密量取去氧紫草素对照品溶液(0.1 mg/ml)各1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml,分别置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成10.0 μg/ml、20.0 μg/ml、30.0 μg/ml、40.0 μg/ml、50.0 μg/ml的溶液，分别取各溶液20 μl进样，在上述色谱条件下进行分析。以对照品浓度(μg/ml)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并进行回归计算可得线性回归方程为：Y=34769X-62579,r=0.9994,表明去氧紫草素在10.00～50.00 μɡ/ml范围内线性关系良好。

2.2.4精密度试验 取线性关系项下取配好的去氧紫草素对照品溶液，连续进样6次，记录在265 nm处去氧紫草素的色谱图，以峰面积计算，RSD值为0.31%，表明仪器的精密度良好。

2.2.5稳定性试验 称取三个产地的紫草粉末，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件进样，分别在0 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h不同时间段内重复进样三次，每次进样20 μl，记录去氧紫草素的峰面积，计算其含量，RSD分别为安徽0.10%，新疆0.07%，山东0.06%，表明三个产地去氧紫草素在10 h内较稳定。

2.2.6重复性试验 分别取山东、新疆、安徽产地的紫草粉末，按“2.1.2”项下的方法分别制备供试品溶液并处理成 6 份，依次进样每次20 μl，平行测定6 次，计算去氧紫草素的百分含量分别为山东71.40%，新疆67.83%，安徽134.37%，RSD值分别为0.04%，0.10%，0.58%。表明方法重复性较好。

2.2.7回收率试验 准确量取已知含量的安徽供试品溶液共9 份，每份1 ml,分别精密加入去氧紫草素对照品适量(约相当于安徽紫草中去氧紫草素含量的80%，100%，120%)，置于5 ml的容量瓶。实验分为三组，每组分为 3 份。按“2.2.1”项下色谱条件进样20 μl，测定峰面积，计算去氧紫草素的含量。测得低、中、高三个不同浓度的平均加样回收率分别为100.17%，112.82%，125.28%，9个加样回收率数据的RSD值0.10%，在误差允许的范围内。

2.2.8样品的含量测定 分别称取山东、新疆和安徽紫草粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，各处理成3份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，山东、新疆、安徽紫草中去氧紫草素的百分含量分别为71.42%、67.77%、135.32%，RSD分别为0.02%、0.04%、0.04%。其结果见表1，实验结果表明，不同产地的紫草中去氧紫草素的含量存在差别。

表1 山东、新疆、安徽产地紫草中去氧紫草素含量测定结果(n=3)

3 讨 论

3.1提取工艺的选择

查阅文献资料可知紫草的提取方法有超声波、浸渍、渗漉、加热回流等。当温度高于60 ℃时，紫草中的成分不稳定[6]。并且紫草中萘醌类化合物对酸碱度、温度、氧等因素都比较敏感[7]，为紫草的提取工艺提出了较为严格的条件。郝鹤等的发现使用超声波提取的方法时无需加热、加压，在常温下即可以进行实验。综合考虑提取效率，设备条件，操作可行性，成本，最终选择超声提取的方法，并且注意控制温度在60 ℃以下。

3.2色谱条件的选择

本实验中考察了甲醇-水(80∶20)，甲醇-水(90∶10)，乙腈-水(60∶40)，乙腈-水(70∶30)，乙腈-水(80∶20)，结果发现乙腈-水(80∶20)为流动相实验效果比较好。在较短的时间能得到较好的峰型，并且分离效果较好，基线稳定，所以最终选定乙腈-水(80∶20)为流动相。去氧紫草素在265 nm、475 nm均有吸收。HPLC分别测定去氧紫草素对照品在两波长处的色谱图，在265 nm处的峰面积大于475 nm处的峰面积，且在265 nm处时峰形较好，因而选择在265 nm处测定。

本实验建立的高效液相色谱法适用于不同产地紫草中去氧紫草素的含量测定，方法操作简单、分析时间较短、线性范围宽、灵敏度高、适应性较强，可以广泛地应用于对紫草药材和紫草提取物的研究。

[1] 葛素囡,王芳,周歌,等. 新疆紫草及其毛状根中萘醌类化合物的研究[J]. 中药新药与临床药理,2015,25(5):675-681.

[2] 刘力丰.紫草化学成分研究进展[J].中国医药指南，2009，7(4):49.

[3] 冯文文,李国玉,谭勇,等. 软紫草与硬紫草萘醌类化学成分的研究[J]. 中国现代中药,2010,11(7):15-18.

[4] 詹志来,胡峻,刘谈,等. 紫草化学成分与药理活性研究进展[J]. 中国中药杂志,2015,40(21):4127-4135.

[5] 郝鹤,李鹏跃,叶和春,等. 新疆紫草7种萘醌类成分的同时测定[J]. 中国实验方剂学杂志,2013,19(18):108-112.

[6] 李晓瑾,谭秀芳,马媛,等. 新疆紫草质量稳定性研究[J]. 新疆医科大学学报,2006,29(11):1045-1046+1049.

[7] 韦英杰,王茉,袁慕荣,等. 紫草效应成分动态变化与稳定性研究[J]. 中药材,2011,(4):611-615.

Content determination of deoxyshikonin of Arnebia Radix in different producing area by HPLC

ZHU Yong-le DONG Na QU Xiao-lan QI Yong-xiu

(Dept.of Pharmacy ,Taishan Medical University,Taian 271016,China)

Objective: To establish a HPLC method for Deoxyshikonin and to determine content of Deoxyshikonin in Arnebia Radix. Methods: HPLC method was adopted, the determination was performed on Symmetry C18 BDS (250 mm×4.6 mm,5 μm) column with mobile phase consisting of acetonitrile-methanol (80:20) at the flow rate of 1.0 ml/min, the detection wavelength was set at 265 nm, and the sample size was 20μl. Results: Deoxyshikonin standard solution had good linear relationship between concentration and peak area in the range of 10.00～50.00μg/ml(r=0.9994);average recovery rates of deoxyshikonin were 100.17%,112.82% and125.28%(RSD=0.10%,n=9);Percentage of deoxyshikonin in Shandong Arnebia Radix, Anhui Arnebia Radix, Xinjiang Arnebia Radix were respectively 71.40%, 67.77% and 135.32%. Conclusion: The content determination method is accurate, effective, fast and reproducible, which can be used to determine the content of deoxyshikonin.

deoxyshikonin;HPLC;different producing area; content determination

R917

A

1004-7115(2017)11-1229-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.11.009

国家级大学生创新创业训练计划项目(201510439195)，山东省高等学校科技计划项目(J16LM10)。

朱永乐，泰山医学院在读学生。

齐永秀，硕士导师，研究方向：药物色谱分析。

2017-09-24)