高永宝,康雨佳,刘 畅，陈 烨

(1.辽宁省药品认证中心,辽宁 沈阳 110007; 2.辽宁大学药学院 辽宁省新药研发重点实验室,辽宁 沈阳 110036)

高效液相色谱法检查单硝酸异山梨酯缓释片中的有关物质

高永宝1,康雨佳2*,刘 畅2，陈 烨2

(1.辽宁省药品认证中心,辽宁 沈阳 110007; 2.辽宁大学药学院 辽宁省新药研发重点实验室,辽宁 沈阳 110036)

目的对中国药典2015版第二部中单硝酸异山梨酯缓释片有关物质检查进行方法学验证.方法采用高效液相色谱法,色谱柱:Diamonsil ODS- C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(25∶75);检测波长:210 nm;柱温:40 ℃.结果流动相不干扰测定.单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和硝酸异山梨酯混合液在浓度范围1.5～12.5 μg/mL内呈良好的线性相关性.方法精密度、重现性、专属性、样品溶液稳定性均良好.主药峰与杂质峰达到完全分离.结论中国药典2015版第二部提出的方法简便、准确、专属性、重现性良好,可用于单硝酸异山梨酯缓释片有关物质的检查.

单硝酸异山梨酯;高效液相色谱;有关物质

0 引言

单硝酸异山梨酯(Isosorbide 5-mononitrate,5-ISMN)为抗心肌缺血药硝酸异山梨酯(ISDN)体内主要活性代谢产物[1],其生物利用度高,个体差异小,特别适用于冠心病心绞痛的防治,疗效优于硝酸异山梨酯(ISDN)及硝酸甘油(GTN)缓释剂,为新一代硝酸酯类药[2].单硝酸异山梨酯用途广泛,毒副作用小,疗效肯定.通过扩张静脉血管,降低前负荷,舒张动脉血管,降低左心室后负荷,从而降低心肌耗氧量.其可扩张冠脉血管,降低左室充盈压,增加心内膜供血,改善左室顺应性[3].单硝酸异山梨酯是目前临床上治疗各型心绞痛的首选药物,特别是对不稳定型心绞痛,治疗效果更佳.在治疗过程中,该药作用时间长,无首过效应,不易产生耐药性,不良反应少[4].经过多年的开发和研究,检索中国食品药品监督管理总局网站,目前国内有注射剂、普通片剂、缓释片,缓释胶囊,普通胶囊、胶丸、滴丸、喷雾剂等多种剂型.美国药典[5]、欧洲药典[6]、英国药典[7]和中国药典[8]均收载了单硝酸异山梨酯的质量标准.故选用中国药典2015版第二部中的单硝酸异山梨酯缓释片有关物质检测方法,本文对该方法进行方法学验证并测定单硝酸异山梨酯缓释片中有关物质的含量.

1 实验材料

1.1 仪器

LC-10AT高效液相色谱仪(日本岛津)、SPD-10Avp 检测器、N2000色谱工作站、电子分析天平(德国梅特勒)、PHS-2F 数字pH计(上海雷磁)、UV-1750紫外分光光度计(日本岛津).

1.2 试剂

单硝酸异山梨酯对照品、2-单硝酸异山梨酯对照品、硝酸异山梨酯对照品、单硝酸异山梨酯缓释片(自制)、乙腈为色谱纯、重蒸馏水.

2 实验方法

2.1 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水(V甲醇∶V水=25∶75)为流动相;柱温:40 ℃;流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm.

2.2 试验溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

取本品20片,研细,精密称取适量(约相当于单硝酸异山梨酯50 mg),精密称定,置50 mL量瓶中,加流动相约35 mL,振摇约20 min,使单硝酸异山梨酯溶解,用流动相稀释至刻度,摇匀,离心,取上清液,滤过,取续滤液作为供试品溶液.

2.2.2 贮备溶液的制备

精密称定单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯对照品各10 mg,置100 mL量瓶中,加流动相振摇,使单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯溶解并定量稀释至刻度,制得每1 mL中各约含0.1 mg的混合溶液,作为贮备溶液.

2.2.3 对照品溶液的制备

精密量取贮备溶液0.5 mL于10 mL量瓶中,加流动相稀释制成每1 mL中各约含5 μg的混合溶液作为对照品溶液

2.3 系统适用性试验

单硝酸异山梨酯峰的保留时间为4.9 min,,理论塔板数按单硝酸异山梨酯峰计算,应不低于2 000.

2.3.1 空白对照试验

取不含主药的流动相溶液20 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图.

2.3.2 定量限

精密称取单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯对照品适量,逐步稀释,用流动相分别制成12 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL溶液,吸取上述溶液20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图.

2.3.3 检测限

精密量取上述单硝酸异山梨酯溶液、2-单硝酸异山梨酯溶液、硝酸异山梨酯溶液适量,逐步稀释,用流动相分别制成4 ng/mL、5 ng/mL、6 ng/mL溶液,吸取上述溶液20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图.

2.3.4 破坏试验

取供试品适量,分别照下述方法进行极端条件下的色谱分离试验:

①热破坏(加热至药物部分变色);②酸破坏(加适量1 mol/L盐酸溶液,水浴加热1.5 h);③碱破坏(加适量1 mol/L氢氧化钠溶液,水浴加热1.5 h);④氧化破坏(加适量30%过氧化氢溶液,放置1 h);⑤强光破坏(强光下照射2 h).取样品①～⑤(酸和碱破坏样品需先调节pH为7),加流动相稀释,滤过,取续滤液20 μL注入色谱仪.所得各色谱图中各新生降解产物峰均能与单硝酸异山梨酯主峰良好分离.

3 结果与讨论

3.1 系统适应性试验

3.1.1 色谱柱选择

选用常用十八烷基硅烷键合硅胶柱,由图1可以看出在该系统中保留时间为4.9 min左右,确定选用该色谱柱.

3.1.2 检测波长的选择

取本品适量,用水制成1 mL中约含量20 μg的溶液,由图2可以看出，在190～500 nm波长内进行扫描,结果本品在254 nm有较大吸收,参照单硝酸异山梨酯质量标准,确定本品检测波长为254 nm.

图1 供试品保留时间

图2 供试品紫外最大吸收波长

图3 空白对照色谱峰

3.1.3 空白对照试验

由图3可以看出，空白组结果除溶剂峰外,无任何色谱峰,表明流动相不干扰测定,方法专属性良好.

3.1.4 定量限

由图4可以看出，其信噪比S/N均约等于10.故单硝酸异山梨酯的定量限为12 ng,2-单硝酸异山梨酯的定量限为15 ng,硝酸异山梨酯的定量限为20 ng.

图4 单硝酸异山梨酯的定量限

3.1.5 检测限

由图5可以看出，其信噪比S/N均约等于3.故单硝酸异山梨酯的检出限为4 ng,2-单硝酸异山梨酯的检出限为5 ng,硝酸异山梨酯的检出限为6 ng.

图5 单硝酸异山梨酯的检测限

3.1.6 破坏性试验

由图6可知，所得各色谱图中各新生降解产物峰均能与单硝酸异山梨酯主峰良好分离.

3.2 含量测定

3.2.1 含量测定法

精密量取“2.2.1”项下供试品溶液,照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定[9].

3.2.2 线性试验

精密量取“2.2.2”项下贮备溶液0.15、0.3、0.5、0.75、1.0、1.25 mL于10 mL量瓶中用流动相分别稀释至浓度约为1.5、3、5、7.5、10、12.5 μg/mL的溶液.精密量取20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图.线性相关性试验结果:由图7可以看出，单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和硝酸异山梨酯混合液在浓度范围1.5 μg/mL～12.5 μg/mL内呈良好的线性相关性.

图6 破坏性试验分离效果

图7 线性试验

3.2.3 精密度试验

精密吸取“2.2.3”项下对照品溶液20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图,重复测定7次,结果单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯峰面积RSD值分别为0.46%,0.56%,0.74%(n=7).

3.2.4 重现性试验

精密量取“2.2.1”项下供试品溶液20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图.连续测定6次,计算峰面积RSD.重现性试验的RSD的值为0.74%<2.0%,说明该方法的重现性符合定量测定的要求.

3.2.5 有关物质稳定性试验

取“2.2.3”项下对照品溶液室温下放置,于0、4、8、12、16、20、24 h后分别测定,结果单硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯的峰面积RSD值分别为1.33%,1.15%,1.21%.结果表明溶液在24小时内相对偏差小于2%,证明该溶液在24小时内是稳定的.

3.2.6 有关物质试验

取本品的细粉适量(约相当于单硝酸异山梨酯50 mg),精密称定,置50 mL量瓶中,加流动相约35 mL,振摇约20 min,用流动相稀释至刻度,摇匀,离心,取上清液,滤过,取续滤液作为供试品溶液;另取硝酸异山梨酯对照品和2-单硝酸异山梨酯对照品,精密称定,加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中各约含5 μg的混合溶液作为对照品溶液.照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定,供试品溶液的色谱图中,如有与硝酸异山梨酯峰和2-单硝酸异山梨酯峰保留时间一致的色谱峰,按外标法以峰面积计算,均不得过单硝酸异山梨酯标示量的0.5%.

结果,由图8可以看出在有关物质检查色谱图中,主成分峰保留时间为6.8 min,硝酸异山梨酯保留时间为6.0 min,2-单硝酸异山梨酯保留时间为4.1 min,因而主成分峰与杂质峰达到了完全分离.

图8 单硝酸异山梨酯有关物质保留时间

3.3 讨论

本文对药典提出的色谱方法进行全面的方法学验证,结果表明此方法简便、准确、专属性、复现性等良好,可用于单硝酸异山梨酯缓释片有关物质的检测.

[1] Smith RV et al.microchemical J,1978,23:185.

[2] 刘兆平,刘亚玲,吴葆杰.新一代硝酸酯类药单硝酸异山梨酯[J].世界临床药物,1990(4):218-221.

[3] 彭芳,陈植和,王德成.单硝酸异山梨酯药动学和药效学特点及机制探讨[J].大理学院学报:医学版,1999(3):75-77.

[4] 张晓霞,李妍,杨慧茹.单硝酸异山梨酯治疗心绞痛不良反应的护理[J].中华全科医学,2007,5(4):376-376.

[5] USP36-NF31 4005,4007,4009.

[6] European Directorate For the Quality of Medicines.EP 8.0:2542.

[7] British Pharmacopoeia 2013 Volume I & II Medicinal and Pharmaceutical Substances.

[8] 国家药典委员会.中国药典2015年版第二部[S].2015:692-693.

[9] 国家药典委员会.中国药典(四部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

(责任编辑李超)

DeterminetheRelatedSubstancesofIsosorbideMononitrateSustainedReleaseTabletbyHPLC

GAO Yong-bao1,KANG Yu-jia2*,LIU Chang2,CHEN Ye2

(1.CertificationCenterforDrugs,Liaoning,Shenyang110007,China; 2.DepartmentofPharmacyofLiaoningUniversity,NewDrugR&DKeyLaboratoryofLiaoningProvince,Shenyang110036,China)

Objective：Chinese Pharmacopoeia 2015 edition of the second part isosorbidedinitrate sustained-release tablets were related substances method validation .MethodsThe HPLC method was carried out,the column:Diamonsil ODS-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm);mobile phase:methanol-water (25∶75);detection wavelength:210 nm.ResultsThe mobile phase does not interfere with the determination.Isosorbidedinitrate,2 isosorbidedinitrate and isosorbidedinitrate mixture in a concentration range of 1.5 ～ 12.5 μg/mL showed a good linear correlation.The method precision,reproducibility,specificity,sample solution stability were good.Main drug peak and impurity peaks completely separated.ConclusionChinese Pharmacopoeia 2015 edition of the second portion of the proposed method is simple,accurate,specific,reproducibility,and can be used for single-isosorbidemononitrate sustained release tablets checks related substances.

IsosorbideMononitrate;HPLC;related substances

2017-01-23

高永宝(1966-)，男，高级工程师，从事原料药新药及其合成工艺研发、质量研究、GMP.

*

康雨佳(1992-)，女，辽宁大学2014级药物化学在读硕士，从事药剂药分方面工作，E-mail：1220535228@qq.com.

R 917

A

1000-5846(2017)03-0251-06