王芳　岳朝敏　阮琴

摘要：以艾叶（Artemisia argyi）为原料，通过超声波辅助提取得到叶绿素，经皂化、酸化、锌代等过程，制得叶绿素锌钠盐，并对其稳定性进行了初探。结果表明，该产品的水溶性较好，具有较好的耐热性，对氧化剂、还原剂不敏感，在pH为5～11的环境中均较稳定，但在光照条件下稳定性差。几种常见的食品添加剂和一些金属离子对叶绿素锌钠盐的影响小，但Fe3+、Cu2+、Al3+、柠檬酸和维生素C对叶绿素锌钠盐的稳定性有较大影响。

关键词：艾叶（Artemisia argyi）；叶绿素锌钠盐；制备；稳定性

中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）20-3921-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.031

Abstract： Chlorophyll was extracted from Artemisia argyi with ultrasonic-assisted extraction. Sodium zinc chlorophyllin was prepared from the chlorophyll extracting through the processes of saponification， acidification and zinc substitution. Results showed that sodium zinc chlorophyllin has high water-solubility， good heat resistance at certain temperature， high resistance abilities to oxidants and reducers， and it is stable in the environments of pH 5～11. But it has poor stability under sunshine. And the food additives and metal-salts have little effect on the stability of sodium zinc chlorophyllin. However， it would be influenced by Fe3+，Cu2+，Al3+，citrate and vitamin C.

Key words： Artemisia argyi； sodium zinc chlorophyllin； preparation； stability

葉绿素是较早开发的一种天然的色素，其安全无毒，并具有抗氧化[1]、降血脂、降血糖等诸多功能[2]，但游离的叶绿素不稳定，所以给其应用带来了困难[3]。如果将叶绿素制成叶绿素锌钠盐，可增加稳定性，并且能起到一定的补充锌作用[4]。目前，叶绿素锌钠盐广泛应用于医药、化妆品、饮料中，而且对癌症的治疗也有一定的作用[5]。

艾叶（Artemisia argyi）又名艾蒿、艾，为菊科蒿属多年生草本植物[6]，在医药、食品、香料等行业都有使用[7]，主要成分有挥发油[8]、叶绿素、黄酮类化合物[9]等。虽然艾叶中含有丰富的叶绿素，但是其叶绿素的开发应用尚未见报道，研究艾叶叶绿素锌钠盐的制备工艺及其稳定性，为艾叶进一步开发应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

艾叶：采自浙江省金华市。

乙醇、氢氧化钠、盐酸、石油醚、硫酸锌、氯化钠、柠檬酸、过氧化氢等均为分析纯。

1.2 仪器设备

UV-2550型紫外分光光度计；新T6型分光光度计；JY-92Ⅱ型超声波细胞破碎仪；HWS28型恒温水浴锅等。

1.3 方法

1.3.1 工艺过程 将新鲜艾叶清洗干净，剪碎，加入体积分数95%乙醇溶液，超声波处理一定时间，抽滤弃渣，滤液置于烧瓶中，加入5%NaOH调节pH至11，于65 ℃恒温水浴加热1 h。然后减压蒸馏回收乙醇，浓缩液用同体积的石油醚萃取3次，得叶绿素皂化液，用0.1 mol/L的HCl调节溶液pH至2～3，而后不断搅拌缓慢加入20%的ZnSO4溶液（料液比为1∶5），于75 ℃水浴加热2 h。减压抽滤，将所得的固体水洗3次，用5%NaOH溶液溶解沉淀，并于低于60 ℃条件下烘干，即得叶绿素锌钠盐成品[10]。

1.3.2 超声波有机溶剂提取叶绿素工艺的优化 在前期试验基础上，选择料液比、超声时间、提取温度和提取时间为考察因素，以叶绿素提取量作为考察指标，进行L9（34）的正交试验（表1），优化叶绿素提取的工艺。

1.3.3 叶绿素锌钠盐的光谱特性 称取叶绿素锌钠盐0.1 g，蒸馏水溶解并定容100 mL，制得0.1%的水溶液，用紫外分光光度计在380～800 nm波长范围内进行扫描。

1.3.4 叶绿素锌钠盐的稳定性研究 取50 mg叶绿素锌钠盐，蒸馏水溶解并定溶于1 000 mL，制得0.005%的叶绿素锌钠盐溶液，作为试验应用液。

1）温度对叶绿素锌钠盐的影响。每份取10 mL叶绿素锌钠盐试验应用液密封于试管中，分别于4、30、50、70、95 ℃下放置4 h。每隔1 h测定溶液的吸光度，3次重复。

2）光照对叶绿素锌钠盐稳定性的影响。每份取10 mL叶绿素锌钠盐试验应用液密封于试管中，分别放置于暗处和自然光下静置8 h。每隔2 h测定溶液的吸光度，3次重复。

3）氧化剂、还原剂对叶绿素锌钠盐稳定性的影响。每份取10 mL叶绿素锌钠盐试验应用液密封于试管中，分别加入2 mL不同浓度（0、0.5%、2%、6%、10%）的H2O2、Na2SO3溶液，在室温下避光静置1 h，测定其吸光度，3次重复。endprint

4）金属离子对叶绿素锌钠盐稳定性的影响。每份取10 mL叶绿素锌钠盐试验应用液密封于试管中，然后分别加入2 mL 0.1 mol/L含有不同金属离子（Na+、Ca2+、K+、Cu2+、Al3+）溶液，同时对照加2 mL的蒸馏水，在室温下避光静置1 h，测定其吸光度，3次重复。

5）常用食品添加剂对叶绿素锌钠盐稳定性的影响。每份取10 mL叶绿素锌钠盐试验应用液密封于试管中，分别加入质量分数为0.5%的维生素C和柠檬酸溶液，质量分数为2%的氯化钠、葡萄糖和蔗糖溶液各2 mL，在室温下避光静置1 h，测定其吸光度，3次重复。

6）pH对叶绿素锌钠盐稳定性的影响。每份取10 mL叶绿素锌钠盐试验应用液密封于试管中，分别用0.1 mol/L HCl和NaOH调节配制成pH为3、5、7、9、11、13的叶绿素锌钠盐溶液，室温下避光静置1 h，测定其吸光度，3次重复。

2 结果与分析

2.1 超声波有机溶剂提取叶绿素正交试验结果

在前期试验基础上，进行L9（34）的正交试验，结果如表2所示。影响艾叶叶绿素提取因素中，其主次顺序为料液比>提取温度>超声时间>提取时间，最终确定优化条件为料液比1∶10，超声功率50 W，超声时间8 min，提取温度65 ℃，提取时间20 min。将提取到的叶绿素溶液，按“1.3.1”工艺过程制备叶绿素锌钠盐，20 g新鲜的艾叶制得叶绿素锌钠盐0.266 g，得率为1.330%。

2.2 叶绿素锌钠盐的特征光谱

从图1可以看出，由艾叶制成的叶绿素锌钠盐在380～800 nm波长范围内有2个吸收峰，分别是410 nm和656 nm，且最大吸收峰在410 nm，与赖海涛等[11]用茶叶制得的叶绿素锌钠盐的特征吸收峰相似。因此，以最大吸收波长410 nm处测得的吸光度為参比，探讨叶绿素锌钠盐的稳定性。

2.3 叶绿素锌钠盐的稳定性研究

2.3.1 温度对叶绿素锌钠盐稳定性的影响 由图2可知，叶绿素锌钠盐溶液在70 ℃及以下温度时表现均较稳定，处理4 h吸光度下降不超过10%；温度为95 ℃时，处理4 h后，叶绿素锌钠盐溶液的吸光度显著下降（P<0.05），比处理0 h的下降了42.9%。说明温度在70 ℃以内，叶绿素锌钠盐的稳定性相对较好，随着温度的进一步升高，叶绿素锌钠盐的稳定性下降。

2.3.2 光照对叶绿素锌钠盐稳定性的影响 结果（图3）表明，叶绿素锌钠盐对光敏感，光照2 h，下降幅度就达86.7%，而在避光条件下，8 h仅下降了10.7%。这可能是光照加快了叶绿素锌钠盐的分解[12]，所以在叶绿素锌钠盐使用和贮存的过程中应避免阳光直射。

2.3.3 氧化剂、还原剂对叶绿素锌钠盐稳定性的影响 由图4可看出，经不同浓度的Na2SO3和H2O2处理后，叶绿素锌钠盐溶液的吸光度无显著性变化（P>0.05）。由此可见，氧化剂和还原剂对叶绿素锌钠盐的稳定性影响较小。

2.3.4 部分金属离子对叶绿素锌钠盐稳定性的影响 从图5可以看出，与CK（对照组）相比，Na+、Ca2+和K+ 3种金属离子的存在对叶绿素锌钠盐溶液的吸光度并没有显著影响（P>0.05）。而添加Cu2+、Al3+的处理，叶绿素锌钠盐的稳定性下降，这说明叶绿素锌钠盐溶液对Cu2+、Al3+金属离子较敏感，加工贮存时应注意避免与其接触。

2.3.5 常用食品添加剂对叶绿素锌钠盐稳定性的影响 从图6可以看出，相较对照组，加入质量分数为0.5%的柠檬酸和维生素C后，叶绿素锌钠盐溶液的吸光度显著下降（P<0.05）。而当加入质量分数2%的葡萄糖、蔗糖和氯化钠溶液后，叶绿素锌钠盐溶液的吸光度没有明显的变化。由此可知，叶绿素锌钠盐溶液对柠檬酸和维生素C较敏感，使用时应注意。而葡萄糖、蔗糖和氯化钠对其没有明显影响。

2.3.6 pH对叶绿素锌钠盐稳定性的影响 结果（图7）表明，在pH 5～11范围内，叶绿素锌钠盐溶液的吸光度无显著性变化（P>0.05）（与pH 7时的吸光度比较，下同）。但当pH 3和pH 13时，样品溶液吸光度显著降低（P<0.01）。由此可知，叶绿素锌钠盐在pH为5～11的环境中比较稳定，在强酸和强碱的环境中稳定性下降。

3 结论

1）艾叶叶绿素较适宜提取工艺为提取溶剂95%乙醇，料液比1∶10，超声功率50 W，超声时间8 min，提取温度65 ℃，提取时间20 min。所得叶绿素溶液经皂化、酸化、锌代、水洗、5% NaOH溶液溶解、烘干，得叶绿素锌钠盐，得率达1.330%，产品颜色为墨绿色、且具有金属光泽、水溶性好。

2）艾叶叶绿素锌钠盐对光较敏感，在70 ℃及以下温度稳定性较好，氧化剂和还原剂对其稳定性影响很小。Na+、Ca2+和K+对叶绿素锌钠盐稳定性无明显影响，而Cu2+、Al3+对其有不良影响。在pH 5～11的环境中均较稳定。常见食品添加剂对叶绿素锌钠盐稳定性影响不大，但是要避同柠檬酸和维生素C共用。

4 讨论

本试验中艾叶叶绿素锌钠盐具有金属光泽，水溶性好等特性，这与郭瑞华等[13]对柏树叶叶绿素锌钠盐的研究一致。植物色素的稳定性会受光照、温度、氧化剂、还原剂等因素的影响，艾叶叶绿素锌钠盐具有光不稳定性，热稳定性，强酸（pH 3）强碱（pH 13）时性质不稳定，抗氧化还原能力较好，这与丁林等[14]对石榴叶叶绿素锌钠盐稳定性的研究以及丁洁等[15]对叶绿素锌钠盐的理化性质及其应用研究的结果相似。柠檬酸和维生素C对叶绿素锌钠盐的稳定性影响较大，这可能是在酸性的环境中锌离子被氢离子取代，形成脱金属的卟啉结构[16]，导致稳定性下降。

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