单建军， 管崇武， 张 颖， 张宇雷， 吴 凡， 王俊钧， 张海耿， 宋奔奔

(1 农业部渔业装备与工程重点实验室，中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，上海200092; 2 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨150070; 3 荣成出入境检验检疫局，山东 威海 264300; 4 林德气体上海有限公司，上海 201206)

基于循环水孵化系统的俄罗斯鲟受精卵孵化性能研究

单建军1， 管崇武1， 张 颖2， 张宇雷1， 吴 凡1， 王俊钧3， 张海耿1， 宋奔奔4

(1 农业部渔业装备与工程重点实验室，中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，上海200092; 2 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨150070; 3 荣成出入境检验检疫局，山东 威海 264300; 4 林德气体上海有限公司，上海 201206)

目前，绝大多数海淡水增养殖鱼类的苗种繁育几乎完全是人工繁殖，但对受精卵的孵化方式的研究较少，尤其循环水孵化方面。为探索封闭循环水孵化系统对鲟鱼(Acipenseriformes)受精卵孵化性能的影响，本文通过对俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedtii)受精卵孵化率、孵化酶组成和含量以及孵化过程中水体氨氮浓度变化规律进行研究。结果显示，封闭循环水孵化系统中总氨氮浓度随孵化时间呈线性增长，受精卵的排氨率为60～90 mg/(g·h)，破膜6 h后孵化率为86%，孵化水体中孵化酶累积较严重。俄罗斯鲟的孵化酶主要由分子量为41.3 kDa的蛋白质组成，受精卵的孵化液由23种蛋白质组成，其中包括7种水解酶。研究表明，对氨氮的去除及孵化酶控制技术是循化水孵化系统急需攻克的首要问题。

俄罗斯鲟；循环水；孵化系统；受精卵；破膜率；孵化酶

鲟鱼(Acipenseriformes)是一种古老的软骨硬磷鱼类， 迄今已有2 亿多年的历史。鲟鱼鱼子酱营养丰富、味道鲜美[1-2]。自2006年以来，中国已成为世界鲟鱼养殖大国，鲟鱼养殖产量占世界鲟鱼的80%以上，建立了集繁育-养殖-加工于一体的完整的产业链，年需鲟鱼苗种达1.2亿尾[3-4]。俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedtii)，隶属于鲟形目、鲟科、鲟属，具有体型大、生长快、繁殖能力强，对不良环境耐受能力强等特点，是鲟鱼养殖的主要品种之一[5-6]。其肉质鲜美、性成熟时间早、鱼卵粒大饱满、鱼子酱经济价值高，因此，养殖规模不断扩大，养殖前景广阔。鲟鱼受精卵的孵化主要采用流水方式，具有孵化能力高、孵化死亡率低、易剔除死卵等优点，但同时也存在耗水量大、孵化条件要求高、易受气候条件、环境变化影响等缺点[7-8]。工厂化循环水鱼卵孵化系统是一种机械自动化程度高、节水节地的新型苗种孵化模式，其特点之一就是鱼卵孵化环境可控[9]。目前，有关俄罗斯鲟的研究多集中在种质改良及养殖生物学等方面[10-11]，有关其鱼卵孵化方式的研究还尚未见报道。

在个体发育过程中，鱼类受精卵的孵化标志着胚胎发育的完成和胚后发育的开端。鱼类苗种孵化是胚体运动、孵化酶溶解卵膜内层等因素综合作用的结果[12-13]。作为鱼卵孵化的决定性物质之一，孵化酶由孵化腺分泌，具有类似胰酶或胰蛋白酶的性质，它是各种蛋白质水解酶的组合[13]。本研究构建了俄罗斯鲟受精卵的封闭式循化水孵化系统，通过研究俄罗斯鲟受精卵的孵化率及孵化过程中水体氨氮浓度的变化规律，并采用生化方法测定孵化后1～6 h孵化液蛋白浓度的变化、孵化液蛋白质组成及孵化酶的组成等，初步了解循环水孵化系统下俄罗斯鲟受精卵的孵化性能及孵化酶代谢规律，为鲟鱼繁育技术的改进提供理论数据和技术方法。

1 材料与方法

1.1试验材料及装置

俄罗斯鲟受精卵购于杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司，平均受精卵重量为(0.017 5±0.003 1)g。试验地点位于中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所实验室内，试验装置示意图见图1。系统由1个玻璃钢瓶式孵化器(30 L)和一个玻璃缸处理槽(600 mm×500 mm×400 mm)组成，孵化用水通过水泵从水泵仓抽上来，经过紫外线杀菌装置后进入瓶式孵化器，孵化用水从瓶式孵化器的出口排出进入鱼苗池，鱼苗池出口处铺设过滤网用以过滤卵膜及其他颗粒污染物，之后水流依次经过活性炭仓和生物填料仓进行吸附和生物处理，再由水泵注入紫外杀菌装置消处理后进入瓶式孵化器，从而实现水体循环利用。在本次试验研究过程中，生物填料与活性炭均未放置，每套系统总水体量0.1 m3，1 h 循环10次。

图1 试验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of the testing apparatus

1.2试验设计

1.2.1 受精卵排氨率

采用停用循环水试验装置的生物处理功能进行排氨率研究。设置4组平行试验组，每组系统的瓶式孵化器里放置1 000枚俄罗斯鲟受精卵，生物填料仓和活性炭仓不放置滤料和活性炭，每隔1 h测定出口处的氨氮(TAN)浓度，连续测量8 h，实验期间，溶氧(DO)浓度≥6，pH 8.03～8.49，水温19.0℃～20.4℃。

1.2.2 受精卵孵化率、孵化酶的组成及含量

通过观察受精卵孵化状态，采用考马斯亮蓝法检测水中总蛋白浓度，观察循环水条件下水中孵化酶的浓度累积程度。在发现有受精卵破膜孵化出仔鱼后，每隔1 h测定水中总蛋白浓度，并捞出仔鱼统计孵化率(100%×孵出仔鱼数/受精卵数)。采用LC-MS/MS串联质谱分析，对水体中孵化酶的组成及成分进行分析。

1.3试验方法

1.3.1 排氨率计算

水体中氨氮浓度采用纳氏试剂法测定，排氨率计算公式[14]：

(1)

式中：Ram为排氨率，mg/(g·h)；C0、Ct分别为起始氨氮浓度和t时间后氨氮浓度，mg/L；V为瓶式孵化器容积，L；m为受精卵重量，g；t为实验时间，h。

1.3.2 受精卵孵化液制备

待90%以上的胚胎孵化后，用滤网捞出孵出仔鱼，所得培养液即为孵化液。取100 mL孵化液，于4℃缓慢加56.8 g 硫酸铵，边搅拌边加至饱和，该步骤在5～10 min完成，继续搅拌20 min。在4℃，10 000 r/min冷冻离心10 min，弃上清液，所得沉淀为浓缩孵化酶液。加1倍体积0.2 mol/L 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.0)，转入透析袋，在4℃下透析。每4 h换1次缓冲液，共换4～5次，得到除盐浓缩孵化酶液。

1.3.3 总蛋白测定

孵化酶粗品和Sephacryl S-100纯化样品经离心管浓缩和脱盐后，采用考马斯亮蓝法(南京建成)测定总蛋白浓度。

1.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳分析

除盐浓缩孵化酶液组成成分分析：将已鉴定的孵化酶组分进行PAGE分离，采用垂直板连续体系在4℃电泳，凝胶浓度7%，电流20～30 mA，采用考马斯亮蓝染色，然后对电泳结果进行扫描摄影，根据条带数来确定孵化酶的组分数量。孵化酶组分分子量测定：采用SDS-PAGE垂直板连续体系，凝胶浓度1.25%，电流50 mA，其中标准蛋白依次为兔磷酸化酶B(97400Da)、牛血清标准蛋白(66200Da)、兔肌动蛋白(43000Da)、牛碳酸醉酶(31000Da)、胰蛋白酶抑制剂(20100Da)，鸡蛋清溶菌酶(14400Da)，指示剂为澳酚蓝。经染色和脱色后立即测量各组分迁移距离，根据公式计算相对迁移率(蛋白移动距离/指示剂移动距离)，并将电泳结果在凝胶成像系统下扫描拍照。以标准蛋白相对迁移率为横坐标，分子量的对数为纵坐标，做标准曲线，根据孵化酶组分的相对迁移率，在标准曲线上读取孵化酶组分分子量。

1.3.5 LC-MS/MS分析

在进行LC-MS/MS分析前，对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理和酶解，步骤如下：

(1)将样品加入浓度10 mM二硫苏糖醇(DDT)在56℃下反应30 min后，加入浓度20 mM碘乙酰胺(IAA)室温下避光反应30 min；(2)加入预冷的丙酮(丙酮∶样品体积比=5∶1)在-20℃沉淀2 h；(3)12 000 r/min，4℃，离心20 min，取沉淀物；(4)加入含1M尿素的三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)20 μL，混悬充分溶解；(5)按酶：蛋白质量比1∶50加入胰蛋白酶(Trypsin)，在37℃下酶解15 h；加入浓度0.5%的三氟乙酸(TFA)终止酶解，浓缩冻干。

采用Eksigent 1D plus色谱仪和ZORBAX 300SB-C18 column反应柱(5 μm, 300,0.1×150 mm)分析，流动相的A液是5%乙腈0.1%甲酸溶液，B液是95%乙腈0.1%甲酸溶液。使用A液复溶样品进行色谱分析。色谱洗脱梯度为0～5 min，5%B；5～70 min，45%B；70～77 min，80%B；77～80 min，5%B；90 min，终止。色谱流速300 nL/min。

采用Triple TOF 5600质谱仪进行质谱分析，MS扫描范围350～1 250 m/z，累积时间0.25 s；MSMS扫描范围100～2 000 m/z，HS高灵敏度扫描模式，累积时间0.1 s。

1.4数据处理

试验结果以平均值±标准差(Mean±SD)，数据用Excel2016统计处理。

2 结果与分析

2.1受精卵孵化过程中水体氨氮浓度的变化

如图2所示，在循环水条件下，孵化过程中水体的氨氮浓度呈线性增长曲线，斜率平均为0.096 6。在30 L的孵化水体中，1 000枚卵在水温19.3℃、溶氧8.96 mg/L的孵化条件下，8 h后产生的氨氮总量平均为(22.20±4.53)mg，平均每枚卵的排氨速率为(2.78±0.57) μg/h，远高于张传骞等[15]对于褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)受精卵孵化时的氨排泄率0.8 nmol/(ind·h)的研究结果。经计算，受精卵孵化过程中排氨率为(158.86±32.57)ug/(g·h)。

图2 水体中氨氮浓度随孵化时间变化曲线图Fig.2 Variation curve of the concentration of ammonia nitrogen with the increasing of hatching period

2.2破膜后孵化液中总蛋白浓度及蛋白亚基组成的变化

在循环水孵化系统中，受精卵的孵化率随破膜时间增加，破膜后6 h受精卵的孵化率达86%(表1)。

表1 俄罗斯鲟受精卵的破膜率及孵化液的蛋白质浓度Tab.1 Rupture rate of the fertilized eggs in acipenseriformes and concentration of protein in the hatching solution

由于水体循环利用，孵化液中的蛋白质浓度随破膜时间的增加而逐渐升高，破膜后6 h，孵化水体中的蛋白质浓度达(2.64 ±0.02)g/L。

如图3和表2所示，俄罗斯鲟受精卵孵化液主要由7种蛋白组成(B1～B7)，其蛋白质的分子量范围为130.9～22.4 kDa。其中，以分子量为130.9 kDa和41.3 kDa 两种蛋白质为主。底鳉(Fundulusgrandis)孵化酶的分子量在15到40 kDa之间[16]，虹鳟鱼(rainbow trout)的孵化酶大小约为10 kDa[16]，鱼类孵化酶的分子量不会变化太大，与其他鱼类的孵化酶分子量比对表明，分子量为41.3 kDa的蛋白质为俄罗斯鲟的孵化酶。

2.3受精卵孵化液中的蛋白质组成

俄罗斯鲟受精卵孵化液的水解酶及蛋白质组成见表3。经LC-MS/MS分析，可鉴定到的水解酶种类为7种，此外还包括16种蛋白质。其中，热应激蛋白不参与受精卵的孵化。

图3 破膜后孵化液中蛋白质的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of protein in the hatching solution after rupture of membranes表2 俄罗斯鲟孵化液中蛋白质的迁移距离和相对迁移率Tab.2 The migration distance and relative migration rate of protein in the hatching solution of acipenseriformes

项目序号相对迁移率迁移距离/cm分子量/kDa粗提孵化酶带B10．110．1130．9带B20．560．5114．3带B31．331．290．1带B41．561．484．2带B52．332．166．4带B63．893．541．3带B75．895．322．4

表3 俄罗斯鲟受精卵孵化液的水解酶及蛋白质组成Tab.3 Hydrolytic enzymes and proteins composition in the hatching solution of the fertilized eggs in acipenseriformes

3 讨论

3.1鱼卵孵化时的排氨率

3.2鱼卵孵化时孵化酶的累积

在鱼类人工孵化过程中，鱼卵在胚胎发育早期发生大量破膜的现象比较常见，这对人工鱼类繁殖生产造成较大的损失[13]。导致胚胎早脱膜现象的原因比较复杂。由于孵化水体中孵化酶的浓度过高是导致早脱膜的主要原因之一，因此在孵化生产中需要防止孵化酶在孵化水体中积累。本研究中，孵化水体中的蛋白质浓度随破膜时间的增加而逐渐升高，破膜后1 h为0.12 g/L，至6 h时已经升至2.64 g/L，表明水体中孵化酶浓度快速累积。紫外杀菌器对于孵化酶浓度的控制没有明显效果，可能是由于受精卵卵膜脱落后会释放大量水解酶及蛋白质进入孵化水体，降低了水体透明度，从而影响紫外杀菌器的工作效率。因此在循环水孵化系统中，对于孵化酶浓度的控制也是系统设计的重点和难点。

3.3鱼类孵化酶的组成

鱼类及两栖动物受精卵的孵化都是借助于孵化酶来完成的。孵化酶与卵壳直接接触，消化鱼卵壳内层的辐射区部分，被降解的卵壳内层轻微膨胀，变成疏松的纤维网状结构[22-23]。了解鱼类孵化酶的性质、孵化机制及其影响因素，对于提高受精卵的孵化率，进而大幅提高种苗育成率将产生重大影响[16]。研究证实，青鳉(Oryziaslatipes)、斑马鱼(Barchydaniorerio)、虹鳟、白斑狗鱼(EsoxluciusL.)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)及河川沙塘鳢(Odontobutispotamophila)等鱼类中均有孵化酶存在。史振平等[24]对牙鲆孵化酶的研究表明牙鲆作为海水鱼中偏口鱼类的代表，其孵化酶在大小、反应温度、pH 值以及酶性质等方面大都与底鳉相似, 均是属于丝氨酸蛋白酶类型的金属蛋白酶。黄颡鱼鱼卵中的孵化酶主要分布在鱼卵外胚层及卵膜内层上，各个孵化时期均有孵化酶存在[25]。对青鳉孵化酶的研究表明，孵化酶由两种Zn-金属蛋白酶组成酶系，分别为高卵壳裂解酶(HCE)和低卵壳裂解酶(LCE)，而虹鳟的孵化酶则为分子量约为10 kDa的碱性蛋白酶[26-28]。本研究中，俄罗斯鲟的孵化酶约为41.3 kDa，与牙鲆(34.8 kDa)、玻璃海鞘(34 kDa)、底鳉 (15～40 kDa)等的分子量大小相似，大于日本鳗鲡 (24 kDa) 、虹鳟(10 kDa) 及白斑狗鱼(10～15 kDa)等孵化酶分子量[16，29-30]。本研究采用质谱技术对俄罗斯鲟的孵化液进行蛋白质组分析，结果表明，多种水解酶及蛋白质参与了俄罗斯鲟受精卵的孵化，而与泥鳅、青鳉等鱼类的两种孵化酶组分的研究结果不同[31]。

4 结论

本研究中，俄罗斯鲟受精卵孵化用水的氨氮浓度积累严重，排氨率为(158.86±32.57)μg/(g·h)，表明在循环水孵化系统中，去除氨氮是系统的重要环节。在封闭条件下受精卵孵化过程中孵化酶的不断累积，受精卵破膜6 h后孵化水体中蛋白质浓度已经升至2.64 g/L，不但致使部分受精卵提前破膜，还降低了孵化水体的透明度，影响紫外杀菌器的正常工作。因此，循化水孵化系统作为新型的鱼类受精卵孵化技术还有许多尚待解决的问题，其中系统内氨氮及孵化酶去除控制技术是其急需攻克首要问题。

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AstudyonthehatchingperformanceoffertilizedeggsinAcipensergueldenstaedtiibasedonthecirculatingwaterhatchingsystem

SHANJianjun1,GUANChongwu1,ZHANGYing2,ZHANGYulei1,WUFan1,WANGJunjun3,ZHANGHaigeng1,SONGBenben4

(1FisheryMachineryandInstrumentResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheriesSciences,KeyLaboratoryofFisheryEquipmentandEngineering,MinistryofAgriculture,Shanghai200092,China; 2HeilongjiangRiverFisheryResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Harbin150070,China; 3RongChengEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Weihai264300,China; 4LindeGas(Shanghai)Co.,Ltd.,Shanghai201206,China)

At present, seawater and freshwater aquaculture fish breeding is almost entirely based on artificial propagation, and less research has been done to the fertilized eggs hatching, especially in terms of circulating water hatching. In order to explore the effect of closed circulating water hatching system on the hatching performance of the fertilized eggs of acipenseriformes, in this paper, the hatching rate of the fertile eggs inAcipersergueldenstaediiacipenseriformes, the constitute and content of hatching enzyme, and the change situation of the concentration of ammonia nitrogen in the water body during the hatching process were studied. The results showed that the total concentration of ammonia nitrogen in the circulating water hatching system increased linearly with the increasing of hatch period; the ammonia excretion rate of the fertilized eggs inAcipersergueldenstaediiwas 60-90 mg/(g·h); the hatching rate was 86% in 6 hours after the rupture of membranes, and the accumulation of hatching enzymes in water body was serious. The hatching enzyme of acipenseriformes is mainly composed of the protein with molecular weight of 41.3 kDa. The hatching solution is composed of 23 kinds of proteins, including 7 kinds of hydrolases. The study showed that the removal of ammonia nitrogen and the hatching enzyme controlling technology are urgently to be resolved for the circulating water hatching system.

Acipersergueldenstaedii; circulating water; hatching system; fertilized eggs; rupture rate; hatching enzyme

10.3969/j.issn.1007-9580.2017.05.004

2017-07-01

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2015CB150703)

单建军(1986—)，工程师，研究方向：工厂化循环养殖。E-mail：shanjianjun@fmiri.ac.cn

管崇武(1980—)，副研究员，研究方向：水产养殖。E-mail：guanchongwu@fmiri.ac.cn

S959;X172

A

1007-9580(2017)-05-019-07