一株高效溶磷真菌MEM07的筛选鉴定及其溶磷条件优化

2017-11-10马卫刘诚邵闯陈玲倪红

绿色科技 2017年20期

马卫　刘诚　邵闯　陈玲　倪红

摘要：从富磷矿区的土壤中，筛选出高效的溶磷真菌，并对其进行了分子生物学鉴定以及溶磷条件的优化。通过溶磷圈法分离、钼锑抗比色法测定菌株对不同难溶性磷酸盐的溶解效果，结合菌落形态特征及ITS rDNA 序列分析对目标菌株进行了鉴定，采用正交试验优化了其溶解磷酸钙的条件。结果表明：溶磷真菌MEM07鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。液体摇瓶培养条件下，真菌MEM07对磷酸钙、磷酸镁、磷酸铝、磷矿粉均有较强的溶解能力，溶磷量分别为1242.49 mg/L、1350.05 mg/L、712.03 mg/L、827.29 mg/L。菌株MEM07溶解磷酸钙的最优条件为：碳源葡萄糖，氮源尿素，当28 ℃、初始pH为7.0时，溶磷量达到1489.71 mg/L。

关键词：溶磷真菌；难溶性磷酸盐；筛选；鉴定；发酵条件优化

中图分类号：S154.3

文献标识码：A文章编号：16749944（2017）20019303

1引言

磷是植物体内蛋白质、核酸、脂类等有机化合物合成的主要元素，是植物生长发育所必需的营养元素之一[1]。我国约74%的耕地土壤缺磷，且大部分磷素是不为植物吸收利用的固化磷，因此在农业生产中往往通过施加磷肥提高作物产量，改善土壤缺磷问题。但施入土壤中的磷肥当季作物利用率比较低，导致土壤中磷不断积累，进而土壤板结、品质退化，污染了生态环境。因此，提高土壤中磷的利用率对改善土壤结构、保护生态环境等方面的研究具有重要意义[2～4]。近年来，从植物根际土壤中筛选得到高效溶解难溶性磷的溶磷菌，来改善土壤品质，已成为提高土壤有效磷含量的研究热点[5]，研究证明：土壤中含有大量的溶磷微生物，包括细菌、真菌和放线菌等，可以将难溶性的磷转变成植物可以吸收利用的磷，其中溶磷细菌的数量和种类远多于溶磷真菌，但溶磷真菌的溶磷能力远高于溶磷细菌，并且遗传性状更加稳定[6～8]。已报道的溶磷真菌主要有青霉菌（Penicillium）、曲霉菌（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、镰刀菌（Fusarium）、小菌核菌（Sclerotium）等[9]。磷化工生产的过程中会产生大量的难以利用的磷尾矿和磷矿石，为了对其加以综合利用提高土壤肥力，减少环境污染，笔者在富磷矿区的土壤中，分离、筛选出高效的溶磷真菌，探究其溶磷特性，为加快土壤生态恢复及研制生物菌肥提供实验依据。

2材料与方法

2.1材料

2.1.1筛选溶磷真菌MEM07的土壤

采自湖北省钟祥富磷矿区。

2.1.2无机磷培养基

葡萄糖 10.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、酵母粉0.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3（PO4）2 5.0 g、去离子水1000 mL、pH值7.0～7.2。

2.1.3马铃薯液体培养基（PDA培养基）

马铃薯200 g切成小块与1000 mL水混合煮沸30 min，过滤后取滤液加去离子水至1000 mL，加入葡萄糖20 g，琼脂20 g，自然pH值。

2.1.4酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（YPD培养基）

酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。

2.2方法

2.2.1溶磷真菌MEM07的富集、筛选鉴定和纯化

称取10 g 土壤样品放入装有100 mL 无机磷液体培养基的250 mL锥形瓶中，置于振荡培养箱中28 ℃、150 r/min条件下培養2 d。取富集培养后的土壤悬液0.2 mL，涂布于无机磷固体培养基上，每个处理重复3次，28 ℃倒置培养7 d，对出现溶磷圈的菌株进行纯化，4 ℃保藏。

2.2.2溶磷真菌MEM07的摇瓶复筛

将初筛得到的真菌接种到PDA平板上，待菌落长满后用直径0.6 cm打孔器取一片菌块接种到装有200 mL 无机磷液体培养基的500 mL锥形瓶中，设置空白对照，每个处理重复3次，28 ℃、150 r/min条件下振荡培养，采用钼锑抗比色法测定上清液液中有效磷含量，连续测量7 d[10]。

2.2.3溶磷真菌MEM07的形态学和分子生物学鉴定

依据菌落形态特征，对菌株进行形态学鉴定[11]，同时提取真菌的总DNA为模板，以真菌ITS通用引物ITSl：5—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3；ITS4：5—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3为上下游引物扩增ITS序列[12]。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，送至武汉擎科生物科技公司进行序列分析，测序结果在NCBI上进行Blast对比分析，利用MEGA 6.0 进行系统发育树的构建。

2.2.4溶磷真菌MEM07对磷酸钙、磷酸镁、磷酸铝及磷矿粉溶解能力的实验

将待测真菌接种到PDA平板上，待菌落长满后用直径0.6 cm打孔器取菌块，分别接种到装有200mL难溶性磷酸盐（磷酸钙、磷酸镁、磷酸铝及钟祥磷矿粉的浓度为5 g/L）的500 mL锥形瓶中，每个处理重复3次，同时设置空白对照，在28 ℃、150 r/min条件下振荡培养，采用钼锑抗比色法测定上清液中有效磷含量，连续测量7 d。

2.2.5溶磷真菌MEM07溶磷条件优化

以无机磷培养基为基础培养基分别对氮源、碳源、温度和初始pH值进行优化。碳源分别为为可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖和葡萄糖；氮源分别为牛肉膏、硝酸镁、硝酸钾、硝酸钠、尿素、硫酸铵、氯化铵；初始pH值分别为4、5、6、7、8、9；培养温度分别为25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃和40 ℃，参照2.2.4中的操作方法，培养5 d后测定可溶性磷含量。endprint

以单因素优化结果为基础，采用L9（34）正交试验进一步优化培养基组分（表1），按照2.2.4中的操作方法，培养5 d后测定可溶性磷含量。

马卫，等：一株高效溶磷真菌MEM07的筛选鉴定及其溶磷条件优化

生物与化工

3结果与分析

3.1溶磷真菌MEM07的的富集、筛选鉴定和纯化

真菌MEM 07菌落呈椭圆形，表面凸起，菌落周围有明显水解圈，初期菌丝为白色，后期着生大量黑色孢子，分布均匀（图1）；将测序结果在NCBI上进行Blast 对比分析，并利用MEGA 6.0 进行系统发育树的构建（图2）。结合形态学特征、系统发育分析，将真菌MEM07鉴定为黑曲霉。

3.2溶磷菌株MEM07对磷酸钙、磷酸镁、磷酸铝及磷矿粉溶解能力的实验

将真菌MEM07，分别接种在4种难溶性磷源，即磷酸钙、磷酸镁、磷酸铝及磷矿粉的培养液中，随着时间的延长，培养液中的有效磷含量均呈现先上升后下降的趋势，且在第5 d时有效磷含量均达到最大，它们的溶磷量分别为1242.49 mg/L、1350.05 mg/L、712.03 mg/L、827.29 mg/L（图3）。

3.3真菌MEM07溶磷条件优化

由单因素试验（图4）和正交试验（表2）结果表明，4个因素对菌株溶磷影响的主次顺序为：pH>氮源>温度>碳源。试验得到的最优溶磷条件组合为葡萄糖、尿素、pH值为7.0、温度28 ℃，此时，溶磷量最高为1489.71 mg/L。

圖4（a）碳源、（b）氮源、（c）温度、（d） pH值对菌株MEM07溶磷能力的影响

2017年10月绿色科技第20期

4结论

研究表明不同溶磷菌溶磷能力不同，本研究筛选得到的溶磷真菌MEM07在以磷酸钙为唯一磷源的液体培养基中，溶磷能力可达1242.49 mg/L，优化后溶磷量高达1489.71 mg/L溶磷能力远高于大多数真菌59.64～145.36 μg/mL的溶磷量[13]。菌株MEM07对不同难溶性磷酸盐的溶解能力分别为磷酸镁>磷酸钙>磷矿粉>磷酸铝，是由于微生物的溶磷能力与自身溶磷机理有关，如分泌有机酸、H2S作用、释放质子、CO2作用和产生磷酸酶[14]。本研究筛选得到的黑曲霉MEM07对不同难溶性磷酸盐均有较强的溶解效果。条件优化后溶磷量最高可达1489.71 mg/L，具有广阔的应用前景。

参考文献：

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