单体江，王 伟，余炳伟，王小晴，吴春银，翁道玥，崔紫宁，王 军*

(1.华南农业大学，林学与风景园林学院/广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642；2.华南农业大学 农学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东 广州 510642)

鱼腥草次生代谢产物及其抗细菌活性

单体江1，王 伟1，余炳伟1，王小晴1，吴春银1，翁道玥1，崔紫宁2，王 军1*

(1.华南农业大学，林学与风景园林学院/广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642；2.华南农业大学 农学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东 广州 510642)

【目的】为了分析和鉴定鱼腥草挥发油的化学组成，测定鱼腥草挥发油和乙酸乙酯层次生代谢产物对7种供试细菌的抑制活性。【方法】本文采用水蒸汽蒸馏法和甲醇冷浸提取法分别提取鱼腥草挥发油和乙酸乙酯层次生代谢产物，通过GC-MS对提取得到的挥发油进行化学成分分析，采用抑菌圈法和TIC-MTT-生物自显影法分别测定挥发油和乙酸乙酯层次生代谢产物对供试细菌的抑制活性。【结果】鱼腥草挥发油的得率为0.09 %，从鱼腥草挥发油中共鉴定出49个组分，占总相对含量的93.35 %，主要成分是β-蒎烯(23.65 %)、2-十三烷酮(12.38 %)、甲基正壬酮(8.55 %)、乙酸冰片酯(4.08 %)、月桂酸(3.77 %)、1-十三烯(3.51 %)、氧化石竹烯(2.97 %)和香附烯(2.59 %)等。鱼腥草挥发油对7种供试细菌均表现出一定的抑菌作用，其中对黄瓜角斑病菌的抑制活性最强，抑菌圈直径为(20.0±2.0)mm，而对溶血葡萄球菌的抑制活性最弱，抑菌圈直径仅为(8.7 ± 0.6)mm；对桉树青枯病菌和黄瓜角斑病菌的抑制活性要强于硫酸链霉素。鱼腥草乙酸乙酯层次生代谢产物未表现出任何抗菌活性。【结论】鱼腥草中含有丰富的挥发性成分，且抗菌活性物质主要分布于挥发油中；鱼腥草挥发油对桉树青枯病菌和黄瓜角斑病菌表现出较好的抑制活性，对革兰氏阴性菌的抑制活性要强于革兰氏阳性菌。

鱼腥草；次生代谢产物；抗细菌活性

【研究意义】鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜(HouttuyniacordataThunb.)的全草，别名侧耳根、猪鼻孔、鱼鳞草、九莲草等，因挥发油中含有癸酰乙醛即鱼腥草素，带有鱼腥气，故名鱼腥草[1-3]。鱼腥草为多年生草本，广泛分布于我国南方各省区，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效，有“中药抗生素”的美称[4-7]。鱼腥草富含多种维生素、蛋白质和矿质元素，是卫生部确认的“药食两用”资源之一，开发潜力巨大[8-9]。在我国西南地区，鱼腥草是百姓日常生活的必备品，也是多种名吃如酸汤鱼、丝娃娃等的必备佐料，在广东地区则多用来煲汤。前人的研究表明，鱼腥草具有很好的抗菌、消炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和提高免疫力等多种药理作用[10-15]，目前已发现鱼腥草挥发油对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、八叠球菌、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等多种人体病原细菌具有一定的抑制作用，其中对革兰氏阴性菌的抑菌效果的抑菌效果更强[16-17]。由于鱼腥草广泛的药理活性以及较高的营养价值，使得人们研究的重点都集中在药用价值和食用价值方面以及活性成分的提取和分离等方面[18-23]。【前人研究进展】目前尚未见鱼腥草在农业和林业上研究和应用的报道。【本研究切入点】本研究通过水蒸汽蒸馏法和甲醇冷浸提取法分别提取鱼腥草挥发油和乙酸乙酯层次生代谢产物，通过抑菌圈法和TIC-MTT-生物自显影法测定其抑菌活性。【拟解决的关键问题】阐明鱼腥草挥发油的化学组成，评价鱼腥草挥发油和乙酸乙酯层代谢产物对供试细菌的抑制活性，以期为鱼腥草在农林业上的应用提供新的思路，为鱼腥草的综合开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

鱼腥草于2014年8月15日购买自广州市天河区长湴市场，标本由华南农业大学林学与风景园林学院郑明轩老师鉴定。

1.2 供试细菌

供试细菌包括5种革兰氏阴性菌和2种革兰氏阳性菌，分别为根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens，G-)、大肠杆菌(Escherichiacoli，G-)、桉树青枯病菌(Ralstoniasolanacearum，G-)、黄瓜角斑病菌(Pseudomonaslachrymans，G-)、番茄疮痂病菌(Xanthomonasvesicatoria，G-)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，G+)和溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus，G+)，以上菌株由华南农业大学林学与风景园林学院森林保护教研室提供。

1.3 仪器与试剂

6890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(Agilent Technologies，美国)；水蒸汽蒸馏装置(北京永光明医疗仪器厂)；RE5298A 型旋转蒸发器(上海亚荣仪器厂)；硫酸链霉素(Sigma，美国)；C8-C40系列正构烷烃(Sigma，美国)；噻唑兰[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT](Amresco，美国)；氯化钠、无水乙醚、无水硫酸钠、正己烷等均为国产分析纯(北京化学试剂公司)。

1.4 鱼腥草挥发油的提取

参照Lou等[24]的方法，鱼腥草(400 g)，称重后将其装入水蒸汽蒸馏装置内, 加入适量蒸馏水，待温度升至100 ℃后连续蒸馏6 h，收集蒸出的精油，加入一定量的NaCl, 用乙醚萃取3次，萃取液合并，加入无水硫酸钠进行干燥，浓缩萃取液或让乙醚自然挥发，4 ℃密封保存。

1.5 鱼腥草挥发油化学组分的GC-MS分析

鱼腥草挥发油化学组分鉴定在6890N-5975C GC-MS(Agilent Technologies，USA)上进行，色谱柱为DB-5(30 m×250 μm×0.25 μm)，无分流进样，进样口温度230 ℃，进样量为1 μl。升温程序：起始温度70 ℃，保持1 min，然后8 ℃/min上升到120 ℃，保持1 min，然后30 ℃/min上升到150 ℃，保持1 min，然后5 ℃/min上升到175 ℃，保持0 min，然后1 ℃/min上升到180 ℃，保持0 min，然后5 ℃/min上升到240 ℃，保持0 min。电离方式为EI，电离能量70 eV，载气为He，流速1 mL/min，全扫描采集，质子检测器(MSD)检测。通过NIST(2011)谱库检索，与标准化合物的保留时间和质谱图作对比，确定待测成分。

保留系数(retention index，RI)的测定[25-26]：系列正构烷烃C8～C40用氯仿稀释50倍，然后与上述GC条件一样进行分离，记录C8～C40各正构烷烃的保留时间。用线性升温公式计算各成分的RI值：RI=100n+100(lgtx- lgtn)/(lgtn+1- lgtn)，其中tx、tn和tn+1分别为被分析的组分和碳原子数处于n和n+1之间的正烷烃(tn

1.6 鱼腥草乙酸乙酯层次生代谢产物的制备

采用甲醇冷浸提取的方法制备乙酸乙酯层粗提物。将鱼腥草全株(400 g)剪碎，装入1000 mL的三角瓶中，装入适量甲醇，室温下冷浸提取3次，每次7 d，浓缩提取液，水混悬后用乙酸乙酯连续萃取3次，浓缩萃取液即得到乙酸乙酯层次生代谢产物，4 ℃冷藏，备用。

1.7 鱼腥草次生代谢产物抗细菌活性的测定

鱼腥草挥发油抗细菌活性的测定参照赵文越等[27]的方法，略有改进。供试细菌由于长期保存在-20 ℃下，在活性测定前，先用LB 平板进行活化培养(28 ℃, 暗) 48 h，然后挑取单菌落，在LB液体培养基中摇培(28 ℃，暗，150 r/min) 24 h，将菌液浓度稀释到108cfu/mL，备用。倒好平板后，用移液枪分别吸取50 μl菌液，用玻璃棒涂板。用灭菌的镊子夹取无菌的滤纸片放在培养皿中，每皿放置3片，滤纸片保持一定的距离，然后分别在滤纸片上加入5 μl的挥发油，阳性对照为5 μl 0.2 mg/mL的硫酸链霉素，每个处理重复3次。在黑暗条件下培养24 h后用尺子量取抑菌圈直径的大小。

鱼腥草乙酸乙酯层次生代谢产物抗细菌活性的测定参照Shan等[28]的方法。将乙酸乙酯层次生代谢产物用乙酸乙酯和甲醇溶解，用直径为0.5 mm的毛细管点样，点样量为5 μl，点样点越小越好。采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行薄层层析，薄层层析后在薄层板的一侧原点处点5 μl浓度为0. 2 mg/mL 的硫酸链霉素作为阳性对照，备用。将灭菌的LB半固体培养基(琼脂含量为0.5 %)融化，待温度降至40～50 ℃时，取1 mL浓度为108cfu /mL的各菌液分别加入到100 mL的培养基中，迅速摇匀。而后用喷样器将制备好的菌悬液均匀喷洒到层析后的硅胶板(层析液已挥干)上。待培养基在硅胶板上冷却后，将硅胶板置于培养皿中于4 ℃的冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的扩散。而后将其置于28 ℃下保湿培养，12 h后，取出硅胶板，上面喷加外源显色剂噻唑蓝(MTT)，约10 min后，即可观察实验结果。有抗菌活性成分处，供试菌由于受到抑菌成分的抑制而出现抑菌斑；无抗菌活性成分处，供试菌正常生长，通过MTT显色后而出现背景色蓝色，从而与抑菌斑区分开。

2 结果与分析

2.1 鱼腥草挥发油化学成分分析

采用水蒸汽蒸馏法提取鱼腥草中的挥发油，得率为0.09 % (以鲜重为基础)。通过GC-MS分析，从鱼腥草挥发油中共鉴定出49个成分，占总相对含量的93.35 %，鱼腥草挥发油组成成分及其相对含量见表1，总离子流图见图1。从表1中可以看出，鱼腥草挥发油化合物种类丰富，主要是萜烯类、酯类及其含氧衍生物，其中主要成分是β-蒎烯(23.65 %)、2-十三烷酮(12.38 %)、甲基正壬酮(8.55 %)、乙酸冰片酯(4.08 %)、月桂酸(3.77 %)、1-十三烯(3.51 %)、氧化石竹烯(2.97 %)和香附烯(2.59 %)，其相对含量之和为61.50 %，其他成分相对含量均小于2.5 %。何刚等[6]通过水蒸汽蒸馏法从鱼腥草干品药材中53种挥发性成分，其主要成分为β-月桂烯(20.59 %)、十二醛(5.42 %)、β-水芹烯(4.49 %)、α-蒎烯(4.02 %)、甲基正壬酮(3.29 %)、香叶醇乙酸酯(3.33 %)、石竹烯(3.44 %)、石竹烯氧化物(3.57 %)、β-蒎烯(2.97 %)等。宋琛超等[29]对不同产地鱼腥草药材挥发油成分研究发现，各地鱼腥草挥发油的主要有效成分相同，其差异主要体现在物质的相对含量上，其中(-)-4-萜品醇、α-松油醇、桧烯和β-月桂烯等物质含量的差别较大。

表1 鱼腥草挥发油成分分析及其含量测定结果

续表1 Continued table 1

编号Number保留时间(min)RT保留系数RI化合物Compound分子式Molecularformula相对含量(%)Relativecontent97.88510964,7-DiaminobenzofurazanC6H6N4O1.62108.2111109马氏香料二醛DolichodialC10H14O20.19118.59611272,6-二甲氧基苯酚2,6-dimethoxy-PhenolC8H10O30.36129.6981173环庚烷CycloheptaneC7H140.361310.40412004-蒈烯4-CareneC10H160.601412.7521289乙酸冰片酯BornylacetateC12H20O24.081512.9601297甲基正壬酮2-UndecanoneC11H22O8.551613.32413119-十六碳烯酸9-HexadecenoicacidC16H30O20.221713.39913141,5,5-三甲基-6-亚甲基-环己烯1,5,5-Trimethyl-6-methylene-cyclohexeneC10H160.521813.57613212-Methylbicyclo[4.3.0]non-1(6)-eneC10H160.351914.3401352γ-松油醇γ-TerpineolC10H18O0.122014.6081362月桂烯MyrceneC10H160.222114.99813761-十三烯 1-TrideceneC13H263.512215.1321381乙酸香叶酯GeranylacetateC12H20O22.482315.4901394NeodihydrocarveolC10H18O0.402416.28714271-石竹烯 l-CaryophylleneC15H241.342516.5761439顺式-α-红没药烯cis-α-BisaboleneC15H240.502617.5501479AlloaromadendreneC15H240.572717.9241493香附烯α-CypereneC15H242.592818.0311497长叶烯Longifolene-(V4)C15H240.612918.068149810s,11s-Himachala-3(12),4-dieneC15H240.513018.22415042-十三烷酮 2-TridecanoneC13H26O12.383118.8871532Selina-3,7(11)-dieneC15H241.463219.8231569α-法尼烯α-FarneseneC15H241.633319.9671575月桂酸DodecanoicacidC12H24O23.773420.3631590氧化石竹烯CaryophylleneoxideC15H24O2.973520.6251600β-新丁香三环烯β-NeocloveneC15H241.333620.9411622乙酸香茅酯CitronellylacetateC12H22O20.553721.37916531-乙基-2-羟基苯并咪唑1-Ethyl-2-benzimidazolinoneC9H10N2O0.243821.5611666榄香素ElemicinC12H16O30.683922.0211698γ-蛇床烯γ-SelineneC15H240.364022.10117022,3-DimethylphenylisocyanateC9H9NO0.344122.56117242-十五烷酮2-PentadecanoneC15H30O0.454226.9041952去氧紫草素Arnebin7C16H16O42.424327.1081964棕榈酸HexadecanoicacidC16H32O21.324427.5301989三氟甲苯丁二酮1,3-Butanedione,4,4,4-trifluoro-1-p-tolyl-C11H9F3O21.664529.02820581-十三烯1-TrideceneC13H260.524629.26820684-甲基愈创木酚CreosolC8H10O20.224729.3542072叶绿醇PhytolC20H40O0.614829.63820847,10-十六碳二烯酸甲酯7,10-HexadecadienoicacidmethylesterC17H30O20.904929.7392088反油酸(E)-9-OctadecenoicacidC18H34O22.18

图1 鱼腥草挥发油总离子流色谱图Fig.1 TLC of volatile oil from Houttuynia cordata

2.2 鱼腥草挥发油及其乙酸乙酯层粗提物的抗细菌活性

采用抑菌圈法测定了鱼腥草挥发油对7种供试细菌的抑制活性，其结果如图2所示，鱼腥草挥发油对7种供试细菌均表现出一定的抑菌作用，但对不同供试细菌的抑制活性差异较大，其中对黄瓜角斑病菌的抑制活性最强，抑菌圈直径为(20.0±2.0) mm，而对溶血葡萄球菌的抑制活性最弱，抑菌圈直径仅为(8.7 ± 0.6) mm，对其他供试细菌的抑菌圈直径在10.0～14.5 mm。与阳性对照相比，鱼腥草挥发油对桉树青枯病菌和黄瓜角斑病菌的抑制活性要强于硫酸链霉素，对其他供试细菌的抑制活性均比阳性对照弱。总体来看，鱼腥草挥发油对革兰氏阴性菌的抑制活性要强于革兰氏阳性菌。

通过TLC-MTT-生物自显影法测定了鱼腥草乙酸乙酯层次生代谢产物的抗细菌活性，其结果见表2。阳性对照硫酸链霉素对7种供试细菌的抑制活性与抑菌圈法测定的结果一致，而鱼腥草乙酸乙酯层次生代谢产物对7种供试细菌均未表现出任何抗菌活性，说明鱼腥草的抗菌活性物质主要分布于挥发油中。

3 讨论与结论

目前对鱼腥草挥发油成分的研究较多，但都不尽相同，加上不同产地、不同采摘时间、不同部位、不同状态等都会造成鱼腥草挥发油成分的差异，正是这种不确定性，造成了2006年的鱼腥草事件[5, 30-32]。癸酰乙醛被认为是鱼腥草的有效成分[33]，然而本文在鱼腥草挥发油中并未发现癸酰乙醛的存在，这与采用的提取方法有关。曾虹燕等[34]采用3种不同的方法提取鱼腥草挥发油，结果发现3种方法提取的挥发油无相同成分。超临界CO2萃取的鱼腥草挥发油具腥味，其鱼腥草素相对含量高达14.393 %；而水蒸气蒸馏的鱼腥草挥发油不具腥味，不含鱼腥草素。原因可能是在加热条件下，鱼腥草素被氧化为癸酰乙酸，而癸酰乙酸极易降解为甲基正壬酮。石油醚提取的鱼腥草挥发油不含这2种成分[34-35]。本文采用的是水蒸汽蒸馏法，说明癸酰乙醛已被氧化降解为甲基正壬酮。而金寄春[36]研究发现甲基正壬基酮和癸酰乙醛的疗效和药理作用十分相似，是鱼腥草的真正有效成分。本研究中甲基正壬酮也是鱼腥草挥发油的主要成分，其含量高达8.55 %。

图2 鱼腥草挥发油的抗细菌活性Fig.2 Antibacterial activity of the volatile oil from Houttuynia cordata

供试样品Testsamples抗细菌活性AntibacterialactivityAg-tuRa-soXa-veBa-suSt-haEs-coPs-la乙酸乙酯层粗提物Ethylacetateextracts-------硫酸链霉素Streptomycinsulfate+++++++++++++++

注：“-”为无抗菌斑；“+”表明抗菌斑点最大直径d = 0～5 mm，“++”表明d = 5～10 mm，“+++”表明d ≥ 10 mm。Ag-tu：Agrobacteriumtumefaciens，Ra-so：Ralstoniasolanacearum，Xa-ve：Xanthomonasvesicatoria，Ba-su：Bacillussubtilis，St-ha：Staphylococcushaemolyticus，Es-co：Escherichiacoli，Ps-la：Pseudomonaslachrymans。展开剂∶二氯甲烷∶甲醇= 10∶1，v/v。

徐燕[37]测定了鱼腥草乙醇提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、汉逊氏酵母菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为6.25、12.5、25 mg/mL，而黄亮等[38]研究发现鱼腥草乙醇提取液对多粘芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌最小抑制浓度分别为0.06、0.06、0.08、0.08 g/mL。而本研究中乙酸乙酯层次生代谢产物未表现出任何抑菌活性。一方面可能是因为活性物质主要存在于乙酸乙酯萃取后的水层中；另一方面，本文采用的是TLC-MTT-生物自显影法，该方法不仅可以快速简便的检测样品的抑菌活性，而且可以了解样品中化合物的极性[28-39]，但由于样品用量少，达不到最低抑菌浓度，故未表现出抑菌活性。然而鱼腥草挥发油对7种供试细菌均具有一定的抑制活性，说明鱼腥草挥发油是鱼腥草药材的主要活性成分，这与前人的研究结果一致[40]。此外，鱼腥草挥发油虽然对溶血葡萄球菌和大肠杆菌等人体病原菌表现出抑制活性，但是对植物病原菌的抑制活性更强，对黄瓜角斑病菌和桉树青枯病菌的抑制活性更是强于阳性对照硫酸链霉素。因此能否利用鱼腥草挥发油生产抗植物病原菌新型生物农药值得更加深入的研究和探索。鱼腥草各生长发育时期根状茎挥发油的抗菌活性均较好，而地上部分挥发油则只有在其衰老前才具有良好的抗菌活性[41]，且鲜鱼腥草抗菌作用大于干鱼腥草[42]，而桉树青枯病菌、黄瓜角斑病菌和根癌农杆菌均为土传性病害，因此用鱼腥草作为桉树林地的覆盖物或是将鱼腥草与黄瓜轮作或间作或许为桉树青枯病和黄瓜角斑病等的防治提供了新的思路。

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SecondaryMetabolitesfromHouttuyniacordataThunb.
andTheirAntibacterialActivities

SHAN Ti-jiang1, WANG Wei1, YU Bing-wei1, WANG Xiao-qing1, WU Chun-yin1, WENG Dao-yue1, CUI Zi-ning2, WANG Jun1*

(1.Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm/College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China; 2.Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control, College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China)

【Objective】To analyze and identify the chemical composition of volatile oil extracted fromHouttuyniacordata，the inhibition activities of volatile oil and ethyl acetate extracts against 7 different bacteria were determined.【Method】The volatile oil fromHouttuyniacordatawas extracted by hydro-distillation, and the ethyl acetate extracts was extracted by methanol extraction at room temperature. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was used to analyze the chemical compositions of the essential oil，and inhibition zone method and TLC-MTT-bioautography assay were used to detect the inhibitory activities of the volatile oil and ethyl acetate extracts against bacteria, respectively.【Result】The essential oil from fresh weight basis ofHouttuyniacordatawas extracted with the yield of 0.09 %, and forty-nine components from the volatile oil were identified, which accounted for 93.35 % of total contents, of whichβ-Pinene (23.65 %), 2-Tridecanone (12.38 %), 2-Undecanone (8.55 %), Bornyl acetate (4.08 %), Dodecanoic acid (3.77 %), 1-Tridecene (3.51 %), Caryophyllene oxide (2.97 %) andα-Cyperene (2.59 %) were the major compounds. The volatile oil had certain antibacterial activities on 7 test strains, which showed the strongest inhibitory activity againstPseudomonaslachrymansand the weakest onStaphylococcushaemolyticus, and the inhibition zone diameters were (20.0 ± 2.0) and (8.7 ± 0.6) mm, respectively. The antibacterial activities of the volatile oil againstRalstoniasolanacearumandPseudomonaslachrymanswere better than that of streptomycin sulfate. The ethyl acetate extracts fromHouttuyniacordatashowed no antibacterial activity on test bacteria. 【Conclusion】Houttuyniacordatawas rich in volatile components, and the antibacterial active substances were mainly distributed in the volatile oil. The volatile oil showed better inhibitory activities againstRalstoniasolanacearumandPseudomonaslachrymans. The inhibitory activity of volatile oil on gram-negative bacteria was stronger than gram-positive bacteria.

Houttuyniacordata; Secondary metabolites; Antibacterial activities

1001-4829(2017)5-1041-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.010

2016-05-10

广东省普通高校青年创新人才项目(2014KQNCX 034)；广东省林业科技创新项目(2015KJCH043)；广州市珠江科技新星专项(201506010029)

单体江(1983-)，男，博士，讲师，主要从事林木病理研究，E-mail：tjshan@scau.edu.cn；*为通讯作者：王 军(1962-)，男，博士，教授，E-mail：wangjun@scau.edu.cn，Tel:18002265983 。

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(责任编辑 陈 虹)