罗海玲，康红卫，马 俊，琚茜茜，张 力，史卫东*

(1．广西农业科学院蔬菜研究所，广西 南宁 530007；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007； 3.广西大学农学院，广西 南宁 530005；4.广西南宁市委党校，广西 南宁 530007)

菜心受小菜蛾取食前后的碳水化合物和蛋白组代谢变化

罗海玲1,2,3，康红卫1，马 俊4，琚茜茜1，张 力1，史卫东1*

(1．广西农业科学院蔬菜研究所，广西 南宁 530007；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007； 3.广西大学农学院，广西 南宁 530005；4.广西南宁市委党校，广西 南宁 530007)

【目的】分析菜心-小菜蛾互作的生理和蛋白组变化规律，为明确菜心对小菜蛾取食的抗虫信号途径及防御机理提供理论依据。【方法】以四九菜心四叶幼苗为材料，测定菜心叶片接入小菜蛾24 h前后的碳水化合物代谢变化，并应用串联质量标签(tandem mass tag，TMT)标记联合高效液相色谱-质谱 /质谱法(LCESI-MS/MS)技术鉴定菜心接入小菜蛾24 h前后的差异蛋白组变化。【结果】菜心接虫后较对照可溶性淀粉积累减少，可溶性蛋白及可溶性糖(包括蔗糖、还原糖)含量增加；本研究共筛选出差异表达蛋白430个(接虫后较对照上调1.2倍以上的蛋白211个，下调0.83倍以下的蛋白119个)。其中与光合作用合成代谢相关的许多蛋白在小菜蛾取食菜心后下调表达，而与逆境胁迫、糖水解及能量代谢相关的一些蛋白上调表达。【结论】TMT技术能有效地筛选出小菜蛾取食菜心前后的差异表达蛋白，其差异蛋白主要参与生物胁迫、糖代谢、光合作用和呼吸作用的能量及物质的转化等生物过程。

菜心；小菜蛾；碳水化合物；TMT；差异蛋白

【研究意义】菜心是华南栽培规模最大的蔬菜之一，在华南地区蔬菜的周年供应及出口创汇中有着举足轻重的作用，但是近年来由于小菜蛾严重危害使得菜心的生长和品质遭到严重破坏，因此，研究菜心与小菜蛾之间的相互作用，寻找菜心对小菜蛾取食防御相关的蛋白，为从蛋白组水平上明确菜心对小菜蛾取食的抗虫信号途径及防御机理奠定基础，为菜心培育高抗小菜蛾资源及品质改良具有十分重要的意义。【前人研究进展】十字花科植物中存在的异硫氰酸酯化合物为小菜蛾(Plutellaxylostella)幼虫取食的指示剂，也是吸引成虫产卵的次生物[1]，因此这些寄主植物受小菜蛾危害严重。喻国泉等调查结果表明小菜蛾对寄主的产卵具有选择性：小菜蛾对芥菜、菜心的嗜好性最大[2]，再加上小菜蛾一年发生代数多，繁殖系数高，导致小菜蛾害虫猖撅、环境破坏，虽然小菜蛾化学防治方面的研究越来越多，但却忽视了植物、植物次生物质与害虫之间的相互作用，目前，应对害虫取食的自我防御机制及其生物防治研究日益受到人们的重视。菜心在受生物逆境胁迫时，往往会引起植物体内与植物抗逆性相关的生理生化变化[3],产生一系列自我防御机制，而菜心的自我防御机制变化也同样影响小菜蛾生长发育[4]。张游南等研究表明小菜蛾取食诱导的菜心挥发物含量明显高于健康菜心释放的挥发物含量[5]。尹飞等研究表明小菜蛾取食寄主植物2、4、6和8 d后其体内蛋白和糖含量发生明显变化，以菜心为害2 d后蔗糖升高最为显著[6]，考虑菜心幼苗对小菜蛾为害的承受能力，及菜心遭受小菜蛾取食后蛋白质组及营养成分变化的时效性，避免不同发育龄期小菜蛾幼虫对菜心的为害程度的误差，本研究采用TMT等方法测定三龄小菜蛾幼虫取食诱导菜心24 h的菜心的蛋白组和碳水化合物代谢变化。串联质谱标签(TMT)技术是一种通过串联质谱试验方法对不同样品中的蛋白进行同时鉴定和定量的有力工具[7]。徐莹等采用TMT 技术对3 个烟草品种叶片差异蛋白进行了有效地分离和鉴定[8]。【本研究切入点】目前，对于植物诱导防御机制研究都是在基因或基因组水平上进行，鲜有从蛋白组学上去研究菜心对小菜蛾取食的相关防御机制。【拟解决的关键问题】应用TMT技术分析菜心受小菜蛾取食前后的差异表达蛋白质谱，旨在研究菜心与小菜蛾之间的相互作用，寻找到菜心对小菜蛾取食防御相关的蛋白，为明确菜心对小菜蛾取食的抗虫信号途径及防御机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用目前在很多地区都在大规模种植的四九菜心为供试材料，2014年5月1日开始营养钵基质育苗，待菜心长至4叶1心时将菜心幼苗接入三龄小菜蛾幼虫(每株幼苗放1 头幼虫)进行取食，取食24 h后取小菜蛾取食的幼苗叶片及未接虫的幼苗叶片(CK，图1)，液氮速冻后储存于-80 ℃，备用。

1.2 供试虫源

三龄小菜蛾幼虫由广西大学农学院应用昆虫研究所提供。

1.3 测定项目及方法

蔗糖含量测定采用Roe比色法[9]、还原糖含量的测定采用3,5-二硝基水杨酸法[10]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250比色法[10]，淀粉含量采用碘比色法测定[11]。菜心接入小菜蛾24 h前后的差异蛋白组变化应用串联质量标签标记联合高效液相色谱-质谱 /质谱法(LC-MS/MS)技术由景杰蛋白有限公司代测，其蛋白提取采用TCA/丙酮沉淀法[12]。提取的蛋白质样品加入10 mM DTT在37 ℃下还原1 h，室温黑暗条件下还原烷基化处理45 min，按照 1∶50比例在蛋白质样品中加入胰蛋白酶，37 ℃的条件下酶解过夜，然后再按1∶100比例加入胰蛋白酶再消化酶解4 h；取100 μg消化酶解的蛋白加入 TMT 标记试剂平衡至室温，将标记好的样品，进行液相串联质谱分析。

图1 四九菜心幼苗接虫后24 h和CK的图片Fig.1 The young leaves after 24 hours the diamondback moth feeding on ‘Sijiu’ Chinese flowering cabbage and CK

1.4 蛋白鉴定及数据库查询

质谱数据运用Proteome Discoverer软件提取谱图后用MASCOT (v.2.3.0) 搜索引擎中进行蛋白质和肽段鉴定，查询参数参考NCBI芸苔属植物数据库。

1.5 生物信息学分析

生物信息学分析搜库后得到表达量差异结果(上调变化倍数>1.2或下调<0.8，P<0.05视为二者之间差异具有统计学意义)，鉴定得到的差异蛋白采用Gene Ontology(GO)功能富集度分析，同时采用STRING 9.0软件进行差异蛋白的相互作用分析，通过网络图(Network)查看并选择重要的相关互作蛋白进行分析。

1.6 数据统计及处理

试验数据应用Excel 2007和SPSS l9.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 菜心接虫24 h后碳水化合物变化

淀粉是光合作用终产物，也是植物体中贮存的养分。淀粉是葡萄糖的高聚体，在淀粉酶等的作用下能够水解成麦芽糖、葡萄糖。如图2所示，菜心叶片在接入小菜蛾24 h后可溶性淀粉积累显著少于对照，下降54.96 %。

图2 四九菜心接虫前后可溶性淀粉含量变化Fig.2 Effects of diamondback moth on the soluble starch content of Chinese flowering cabbage

图3 四九菜心接虫前后可溶性蛋白含量变化Fig.3 Effects of diamondback moth on the soluble protein content of Chinese flowering cabbage

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，植物中可溶性蛋白可以反应植物体的总体代谢，在许多外界环境胁迫的条件下，可溶性蛋白往往会增加，使植物适应性增强。如图3所示，菜心叶片接入小菜蛾24 h后可溶性蛋白较对照升高8.98 %。

在植物中，光合作用的主要产物为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖合成为淀粉后可暂时储藏在叶中，而淀粉受其生长环境的影响由可转化为麦芽糖和葡萄糖等还原性糖。如图3所示，菜心叶片接入小菜蛾24 h由于虫害逆境的影响，其还原糖较对照显著升高76.37 %。

蔗糖是植物储藏、积累和运输糖分的主要形式，广泛分布于植物体内。蔗糖既是能量储存的重要形式，也是植物体内重要的信号分子。如图4所示，菜心接入小菜蛾24 h后，其蔗糖较对照显著升高了40.12 %。

2.2 菜心接虫24 h后蛋白组变化

2.2.1 肽段质量有效性验证 肽段质量验证图(图6)表明，大多肽段质量误差分布接近0，肽段得分在20分以上(A)，并且大多数肽段长度在8和16间(B)，与胰蛋白酶酶解肽段长度相一致，说明样品制备符合标准。

图4 四九菜心接虫前后还原糖含量变化Fig.4 Effects of diamondback moth on the reducing sugar content of Chinese flowering cabbage

图5 四九菜心接虫前后蔗糖含量变化Fig.5 Effects of diamondback moth on the sucrose content of Chinese flowering cabbage

图6 肽段质量有效性验证Fig.6 Quality Control Validation of MS Data of Chinese flowering cabbage

2.2.2 菜心叶片蛋白组质谱鉴定结果 应用TMT技术联合高效液相色谱-质谱 /质谱法技术鉴定到4196个菜心蛋白肽段，经蛋白数据库搜索，2672个被定量，筛选得到差异表达蛋白430个(接虫后相比对照上调1.2倍以上的蛋白211个，下调0.83倍以下的蛋白119个)。

2.2.3 差异蛋白组GO分析 上调差异蛋白组GO分析：根据UniProt-GOA (www.http://www.ebi.ac.uk/GOA/)数据库对差异蛋白质进行GO(gene ontology)分析，按照功能进行分类，上调蛋白中43 %参与了代谢过程，22 %参与了细胞成分组成，22 %参与了单个有机体生命过程，5 %涉及刺激反应，4 %涉及细胞定位，4 %参与其他反应过程。

下调差异蛋白组GO分析：根据UniProt-GOA (www.http://www.ebi.ac.uk/GOA/)数据库对下调差异蛋白质进行GO(gene ontology)分析，按照功能进行分类，上调蛋白中39 %参与了代谢反应，28 %参与了细胞成分组成，23 %参与了单个有机体生命过程，3 %涉及刺激反应，4 %涉及细胞定位，3 %参与其他反应过程。

2.2.4 差异蛋白分析 这些小菜蛾取食菜心的差异蛋白主要参与生物胁迫、糖代谢、蛋白质与氨基酸代谢、光合作用和呼吸作用的能量及物质的转化等生物过程。

图7 菜心上调差异蛋白功能分类Fig.7 Functional classification of up-regulated proteins

与胁迫相关的许多蛋白如蛋白酶抑制剂、谷胱甘肽过氧化物酶、类CASP蛋白、PR4型蛋白、丙二烯氧合酶、几丁质酶、蛋白酶抑制剂、脂肪氧合酶等在小菜蛾取食菜心后上调表达1.5倍以上，这些蛋白的上调表达有助于菜心启动小菜蛾危害的防御和耐受机制。

而在小菜蛾取食菜心的糖代谢中，β-1,3-葡聚糖酶、糖基转移酶、碱性α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶分别上调表达5.675、1.652、2.177、1.779和1.737倍，而甘露糖-3,5异构酶、依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶、果糖-二磷酸醛缩酶、甘露糖-6-磷酸异构酶等蛋白分别下调为对照的0.786、0.648、0.776和0.664倍。

在蛋白质与氨基酸代谢中，一些编码的蛋白质合成蛋白60 s核糖体蛋白、50 s核糖体蛋白等分别上调表达1.785 、2.353 倍，天冬氨酸转氨酶、天冬酰胺合成酶、半胱氨酸肽链内切酶等与氨基酸合成与分解相关的酶类也都上调表达1.5 倍以上，而脯氨酸顺反异构酶、丝氨酸羟甲基转移酶则分别下调为对照的0.790、0.755倍。

图8 菜心下调差异蛋白功能分类Fig.8 Functional classification of down-regulated proteins

与光合作用等合成代谢相关的许多蛋白下调表达，如光系统l中心反应蛋白、NADP 6-磷酸脱氢酶、叶绿素酯还原酶、铁氧化还原蛋白、转运蛋白、叶绿素Mg-螯合酶亚基蛋白、捕光叶绿素a/b结合蛋白分别下调为对照的0.571、0.740、0.504倍和0.575、0.588和0.490倍；另一方面，与能量和呼吸代谢相关的酶：电子传递黄素蛋白脱氢酶、质子梯度调控蛋白、细胞色素c、ATP合成酶在小菜蛾取食菜心后上调表达1.5倍以上。

综上所述，小菜蛾取食菜心24 h后，与逆境胁迫、糖水解及能量代谢相关的一些蛋白上调表达，与光合作用等合成代谢相关的许多蛋白下调表达，说明菜心受小菜蛾取食后其光合作用下降，一些碳水化合物降解释放能量以维持菜心被取食后的各种生化反应，同时消耗更多能量和上调各种胁迫相关蛋白来应对小菜蛾的取食。

3 讨 论

本研应用TMT技术鉴定出4196个菜心蛋白肽段，筛选得到小菜蛾取食菜心前后的差异表达蛋白430个，有效地筛选出小菜蛾取食菜心前后在调控菜心的防御和耐受反应过程中发挥重要作用的差异表达蛋白，并对差异蛋白质组进行了系列生物信息学和功能分析，为进一步的研究积累了大量的基础数据。此方法获得的差异蛋白质数目远大于刘琳琳等应用蛋白质双向电泳技术鉴定的差异蛋白数(51个)[13]，但由于该方法试剂昂贵，设计实验处理较少，能确定的关键的差异蛋白较为有限，要获得多更关键的差异蛋白，后续研究可设计小菜蛾取食不同菜心品种或不同取食时间的差异蛋白组变化和更多的生理生化实验以验证本实验结果。

表1 部分上调差异蛋白质信息Table 1 A few up-regulated expressed proteins

表2 部分下调差异蛋白质信息Table 2 A few down-regulated expressed proteins

小菜蛾取食菜心前后，差异蛋白组的变化也引起了菜心防御小菜蛾取食的一系列生理变化如叶片可溶性蛋白、可溶性糖含量的升高，可溶性淀粉的下降，这也反映了菜心受小菜蛾取食后需要启动各种防御反应来保护机体，将平时用于生长和发育的碳源和氮源转用于防御，而这些反应的过程需要消耗额外的能量来应对昆虫的取食因此众多抗性胁迫相关蛋白上调表达。

近年来研究表明，虽然不同的逆境胁迫下会导致大量蛋白表达发生变化，但也存在一些共性的地方：①植物被昆虫取食后植物体内与逆境胁迫相关的蛋白包括病程相关蛋白、蛋白酶抑制剂、多酚氧化酶、过氧化物酶、脂氧合酶和苯丙氨酸解氨酶等多种蛋白显著变化[14-17]，与本研究结果相似：小菜蛾取食菜心后菜心叶片类CASP蛋白活性上调3.866倍，PR4型蛋白上调2.878倍，丙二烯氧合酶较对照也上调表达2.503倍，脂氧合酶上调1.603倍，蛋白酶抑制上调1.558倍，这说明这些蛋白在生物胁迫条件下其蛋白组发生了巨大的功能重组，在昆虫取食诱导的植物防御中具有重要作用；这些与胁迫和生物刺激相关蛋白质的上调表达激活了菜心的防御和耐受反应，也导致小菜蛾取食菜心后其可溶性蛋白的升高；②一些糖代谢相关酶，如β-1,3-葡聚糖酶碱性、α-半乳糖苷酶、糖基转移酶等糖苷酶发生显著变化，这与马歌丽、刘琳琳等前人的研究发现一致：糖苷水解酶是昆虫体内重要的酶，其量和质的变化是昆虫适应逆境重要原因之一[13,18]，因此可以推测这些糖苷酶在昆虫取食诱导的植物防御中发挥重要的作用，糖水解及能量代谢相关的一些蛋白上调表达也有可能是导致小菜蛾取食菜心后还原糖显著增加的原因之一；③与光合作用等合成代谢相关的许多蛋白下调表达，与能量和呼吸代谢相关的酶上调表达，其主要关联的一些差异蛋白如柠檬酸合成酶、丙酮酸激酶等参与三羧酸循环糖酵解途径及抗性胁迫相关途径，在植物适应逆境中起到了其它物质无法代替的关键作用[19-21]。

因此，TMT标记联合高效液相色谱-质谱 /质谱法(LC-MS/MS)技术加快了功能基因和蛋白的发现步伐，使得人们能从整体水平上对菜心应答小菜蛾取食防御和耐受机制进行有益的探索研究，为深入研究菜心对小菜蛾取食的防御和耐受应答分子调控机制提供理论依据。

4 结 论

本研究结果表明，小菜蛾取食菜心后的差异蛋白主要参与生物胁迫、糖代谢、光合作用和呼吸作用的能量及物质的转化等生物过程，采用TMT技术，能有效地筛选出小菜蛾取食菜心前后的差异表达蛋白。

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ChangesofCarbohydrateMetabolismandExpressionofProteinsinChineseFloweringCabbageFedbyDiamondbackMoth(Plutellaxylostella)

LUO Hai-ling1,2,3，KANG Hong-wei1， MA Jun4，JU Xi-xi1，ZHANG Li1，SHI Wei-dong1*

(1.Institute of Vegetable,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Guangxi Nanning 530007,China; 2.Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Guangxi Nanning 530007,China; 3.College of Agronomy,Guangxi University,Guangxi Nanning 530004,China; 4.Nanning Municipal Party College of C.P.C,Guangxi Nanning 530007,China)

【Objective】The changes of carbohydrate metabolism and expression of proteins were analyzed to provide the basic theory information for exploring the interactions between the diamondback moth feeding and defense response of Chinese flowering cabbage.【Method】After 24 h the diamondback moth feeding on ‘Sijiu’ Chinese flowering cabbage,the study analyzed rules for soluble starch,soluble protein,sugar and reducing sugar,meanwhile,analyzed expression of proteins by Tandem mass tag (TMT) coupled to two-dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry (2D LC-MS/MS).【Result】The soluble starch accumulation decreased,and soluble protein and soluble sugar (including sugar,reducing sugar) content increased.430 discrepant proteins were detected by bioinformatics analysis using the SEQUEST search engine,211 proteins were up-regulated with a more than 1.2 folds change,and 119 proteins were down-regulated with a less than 0.83 folds.Among them,the ones of photosynthesis were down regulated,while the others related to stress response,some of hydrolytic enzymes and energy metabolism were up regulated.【Conclusion】The TMT was a powerful method for isolating and identifying differentially expressed proteins between the diamondback moth feeding and defense response of Chinese flowering cabbage.Most of them were involved in stress resistance,glycometabolism,photosynthesis,respiration,energy and substance metabolism .

Chinese flowering cabbage; Diamondback moth; Carbohydrate; TMT; Discrepant proteins

1001-4829(2017)4-0773-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.011

2016-12-15

国家自然科学基金项目(31360481)；广西自然科学基金项目(2014GXNSFBA118122)；广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科2013YQ06，2015YM26)

罗海玲(1980-)，女，广西全州人，硕士，助理研究员，主要从事作物生理与分子生物学研究工作，E-mail：luohailing@gxaas.net，*为通讯作者，史卫东，E-mail：shiwd@gxaas.net。

S436.341.2+4

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(责任编辑 王冠玉)