刘尧　马金龙

摘要：利用碱性蛋白酶从花生饼粕中提取花生水解蛋白。研究了稀释倍数对花生饼粕降解的影响，在此基础上对花生水解蛋白提取工艺条件进行优化。确定最佳稀释倍数为10倍体积稀释，在此条件下得到的电泳条带最为清晰。

关键词：花生饼粕；碱性蛋白酶；水解

花生是全球最重要油料作物之一，種植面积仅次于油菜，居油料作物第二位，在世界油脂生产中占有重要地位。但由于传统上把花生看作是提取食用油的原料，蛋白质利用没有得到足够重视，往往因制油后蛋白溶解性能较差而作为动物饲料和肥料，造成蛋白质资源极大浪费。花生蛋白富含人体多种必需氨基酸，不含胆固醇，可消化性高，对维护幼儿发育和人体健康具有重要作用。从花生饼粕中提取蛋白质并改善其功能性质，对增加花生饼粕附加值具有重要现实意义。采用酶法提取花生蛋白作用条件温和，蛋白质多肽链可水解为短肽链，提高蛋白质消化率，并能有效提高蛋白质得率。

1材料与方法

1.1材料

斜面保藏培养基（LB）：蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，琼脂0.5%，pH值7.0，双蒸水制备。

电泳缓冲液（mmol/L）：Tris碱25g，甘氨酸192g，SDS0.1%，双蒸水制备。

液体发酵培养基：酪蛋白酸水解物（干酪素）1%，葡萄糖1.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCl2·2H2O 0.01%，pH值7.0，双蒸水制备

30%凝胶贮备液（30%丙烯酰胺-0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液）（A液）（mol/L）：Tris-Hcl（PH8.8）1.5，SDS 0.4%，双蒸水制备。

4倍分离胶缓冲液（C液）（mol/L）：Tris-Hcl（PH6.8）0.5，SDS 0.4%，双蒸水制备。

5倍样品缓冲液（蛋白质样品处理液）（mmol/L）：Tris-Hcl（PH6.8）60，甘油：25%，SDS：2%，a-巯基乙醇14.4，双蒸水制备。10%（W/V）过硫酸铵溶液；TEMED；1%溴酚蓝。

考马斯亮兰染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0g，甲醇450mL，冰醋酸100mL，双蒸水450mL。

考马斯亮蓝脱色液：甲醇100mL，冰醋酸100mL，双蒸水：800mL。

1.2主要仪器设备

pH计，离心机，电动搅拌器，分光光度仪，恒温水槽，高压灭菌锅，无菌操作台，恒温摇床，培养箱，蛋白质电泳仪，自动分离收集器等。

1.3方法

1.3.1制备斜面：按照培养基的配方

1.3.2发酵培养：将斜面内的菌种接种到液体发酵培养基中，37℃，240 rmp，摇床培养48h。

1.3.3粗酶液提取：取摇床培养48 h左右的发酵液200mL，在4℃下8000 r/min离心20 min，取上清液，得粗酶液。

1.3.4样品的制备：将已粉碎的花生饼粕粉分装在9个10mL离心管内，每管0.5g，分别加入9mL粗酶液。在30～C反应30min。酶解反应后，分别稀释5、10、15、20、25、30、35、40倍，取0.25mL装入lmL离心管内，并装入等体积的5倍样品缓冲液。沸水浴中加热3-5rain后上样。

1.3.5电泳：运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法对所制备的样品分离，染色，脱色后得到实验结果。

2结果

对所得到的胶板进行反复的脱色，可以清晰地看到每一条电泳条带的酶解成果。左数分别是蛋白maker，未稀释酶解条带，5倍稀释，10倍稀释，15倍稀释，20倍稀释，25倍稀释，30倍稀释，35倍稀释，40倍稀释。由图1可以看出，10倍稀释最为清晰。

3讨论

本试验采用大连海域，产碱性蛋白酶菌降解花生饼粕，经SDS-聚丙烯酰氨凝胶垂直板电泳后，可以较好地将花生饼粕内的蛋白降解分离，得到数条清晰的蛋白条带。本实验以稀释倍数为条件，发现10倍稀释下得到的条带最为清晰，为今后继续寻找最适条件打下基础。

4结果

利用碱性蛋白酶从花生饼粕中提取花生水解蛋白。研究了稀释倍数对花生饼粕降解的影响，在此基础上对花生水解蛋白提取工艺条件进行优化。确定最佳稀释倍数为10倍体积稀释，在此条件下得到的电泳条带最为清晰，为今后寻找更为合适的条件奠定基础。