张洋　李青　梅丽娟

摘要：利用稀释平板计数和PCR-变性梯度凝胶电泳（简称PCR-DGGE）等方法，分析化肥（FT）、普通有机肥+化肥（FC）、微生物有机肥+化肥（FB）、不施肥（CK）等不同基肥处理条件下，连作1、3、5、7茬黄瓜土壤细菌、放线菌、真菌数量及多样性的动态变化。结果表明：（1）随着连作茬数的增加，根际土壤微生物数量呈逐渐增加趋势；（2）与对照相比，施用化肥处理总体上明显促进了连作土壤中放线菌、真菌数量的增加，而对细菌数量的增加有明显的抑制作用，施用普通有机肥+化肥对细菌、放线菌数量的增加均有不同程度的促进作用；（3）连作及不同施肥方式对土壤细菌群落结构均能产生不同程度的影响，除对照处理外，其他施肥处理土壤细菌多样性及丰富度随着连作茬数的增加呈下降趋势，相对于化肥及普通有机肥+化肥处理，微生物有机肥+化肥处理对维持连作过程细菌多样性及丰富度具有明显作用；（4）连作均促进了FT、FB、FC等3种施肥处理根际土壤真菌多样性及丰富度的上升，但与对照相比上升幅度较小，在连作7茬后土壤真菌多样性及丰富度表现为FB>FC>FT。

关键词：施肥方式；黄瓜连作；细菌；真菌；多样性；PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）

中图分类号： S154.3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0231-05

隨着我国现代农业的不断发展，设施栽培面积逐年增加并呈规模化趋势。在市场经济驱动下的商品化设施蔬菜生产中，连作障碍普遍发生。黄瓜作为设施蔬菜的主要品种之一，近年来其连作障碍的发生机制及防治受到学者们的广泛关注。已有研究表明，自毒作用、土壤理化性质劣化、土壤微生物区系失衡是黄瓜连作障碍发生的主要原因[1-2]，并且认为土壤灭菌[3]、嫁接[4]、合理轮作[5]、施用有机肥及微生物肥料[6-7]等措施可有效防止黄瓜连作障碍的发生。其中施用有机肥在平衡矿质营养、提高作物品质和产量的同时，可提高土壤微生物活性，有利于土壤健康微生物区系的形成[8-10]。作为一种方便、低成本的农艺措施，合理施用有机肥对黄瓜连作障碍的预防与控制具有重要的实践意义。目前有关施肥方式对黄瓜连作土壤微生物区系影响的研究较少，关于不同施肥方式对黄瓜连作过程土壤微生物区系及多样性动态变化的研究更是鲜有报道[10-12]。本研究基于无机肥（化肥）、有机肥、微生物有机肥，设置不同的施肥处理，跟踪分析不同施肥条件下大棚黄瓜连作过程中土壤微生物区系及多样性的动态变化，以期为黄瓜连作土壤微生物区系的维持及连作障碍的预防及缓解提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验设计

试验于2011年7月至2015年5月在江苏省扬州市农作物品种区域试验站大棚内进行。试验所用土壤为沙质壤土，已经连续4年种植黄瓜，每年种植2茬，共连作7茬。试验共设4个处理，每个处理3次重复，每个处理小区面积为27 m2，小区间隔 25 cm，并采用南北向条垄方式种植，每季收获后将垄拉平、施肥后再起垄，并逐茬沿用。在盛果期每个小区追施1次2.024 kg的复合肥，具体处理和代号见表1。

1.2试验材料

化肥（复合肥，即无机肥）为市售，其中N ∶[KG-*3]P2O5 ∶[KG-*3]K2O 为15 ∶[KG-*3]13 ∶[KG-*3]12；普通有机肥为发酵鸡粪；微生物有机肥由南京农业大学提供。供试土壤基本理化性质：总氮含量1.81 g/kg，总磷含量 0.87 g/kg，速效磷含量43.66 m g/kg，速效钾含量 155.81 mg/kg，有机质含量26.96 g/kg，总盐含量5.67 g/kg，电导率为806.50 μS/cm，pH值为7.80。

1.3土壤样品采集与处理

于每茬黄瓜成熟期对不同处理及各重复小区采用5点法采集黄瓜根际土壤样品，采用4分法混匀后置于4、 -80 ℃ 冰箱中保存。

1.4土样微生物数量测定

采用稀释平板法[13]。分别用牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏孟加拉红培养基、高氏1号培养基对土壤细菌、霉菌、放线菌数量进行测定。微生物数量以1 g干土中的菌落数表示。

1.5土壤总DNA的提取

采用试剂盒（FastDNA SPIN Kit，MP Biomedicals，美国）提取各土壤样品微生物总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，-20 ℃保存。

1.6土样DNA的PCR扩增

分别采用细菌16S通用引物P2/P3+GC[14]和真菌28S通用引物U1/U2+GC[15]对土壤微生物总DNA进行PCR扩增，引物具体信息如表2所示。细菌PCR扩增反应程序为 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。真菌PCR扩增反应程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。

细菌、真菌PCR扩增体系为Taq DNA聚合酶（大连TaKaRa公司）0.25 U，10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/反应，大连TaKaRa公司）4 μL，引物各1 μL（20 μmol/L），牛血清白蛋白（BSA） 5 μL（10 mg/mL），模板DNA 2 μL，无菌水补足至50 μL。

扩增产物均经1.5%琼脂糖凝胶电泳检验后，于4 ℃冰箱中保存。

1.7PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）

采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突变检测系统对PCR产物进行电泳分离。细菌及真菌电泳条件均为8%聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为20%～60%，电泳缓冲液为1×TAE，130 V 电压，60 ℃电泳720 min。电泳结束后用EB染色 30 min，无菌水褪染10 min，最后用Bio-Rad凝胶成像分析系统观察结果并拍照。

1.8数据处理

采用Quantity One 4.6（Bio-Rad）软件对PCR-DGGE图谱进行分析，电泳条带的数量代表细菌和真菌的群落丰富度（S）；通过DGGE图谱的数字化结果分别计算土壤样品中细菌和真菌群落的多样性指数（H），Shannon-Weaver多样性指数

式中ni为每个峰的面积，N为所有峰的面积和，s为条带数。对样品采用不加权平均连锁聚类（UPGMA） 的处理方法进行簇群归类。

2结果与分析

2.1不同施肥处理对黄瓜连作土壤微生物区系的影响

土壤细菌、放线菌、真菌是土壤微生物的主要组成部分，其数量是衡量土壤中微生物区系健康状况的1个重要指标。由图1-a可知，随着连作茬数的增加，各施肥处理根际土壤细菌数量均呈增加趋势；微生物有机肥+化肥处理（FB）根际土壤细菌数量除连作第5茬外其他茬均显著高于其他处理；化肥处理（FT）细菌数在黄瓜连作各阶段均低于对照，且从连作第3茬开始差异达显著水平。上述结果说明，随着连作茬数的增加，各肥料处理根际土壤细菌数量均持续增加，但相对于同茬对照处理，化肥处理对细菌数量有明显的抑制作用，而有机肥+化肥处理（FC、FB）尤其是微生物有机肥+化肥处理（FB）对细菌增加有明显的促进作用。

由图1-b可知，随着连作茬数的增加，各施肥处理根际土壤放线菌数量均呈增加趋势；与CK处理相比，FT处理的放线菌数量除连作第3茬外其他茬均显著高于CK处理； FB处理的放线菌数量除连作第3茬外均显著高于CK处理，且随连作茬数的增加，其增幅逐渐明显高于FT处理；FC处理除连作第1茬外根际土壤放线菌数量均高于其他处理。上述结果表明，随着连作茬数的增加，各肥料处理根际土壤放线菌数量均持续增加，与对照相比，化肥、普通有机肥+化肥、微生物肥料+化肥处理对放线菌数量增加均有不同程度的促进作用，其中，普通生物有机肥+化肥的促进作用在各茬次均比较明显。

由图1-c可知，随着连作茬数的增加，各施肥处理根际土壤真菌数量均呈增加趋势；相对于CK处理，各连作茬次FT处理除连作第3茬外其他茬土壤真菌数量均明显提高，而FC、FB处理真菌数量在不同茬次表现为高低交替状态，其中FC处理根际土壤真菌数量均除连作第1茬外显著高于其他处理。上述结果表明，随着连作茬数的增加，各肥料处理根际土壤真菌数量均持续增加。

2.2不同施肥处理对黄瓜连作土壤细菌群落结构及多样性的影响

依据不同施肥处理连作第 1、7茬土壤细菌PCR-DGGE指纹图谱（图2-a），进行群落结构聚类分析（图2-b）。结果显示，相对于CK，不同施肥处理对同茬土壤细菌群落结构的影响存在差异，连作前期表现为FB>FC>FT，连作7茬后表现为FB>FT>FC；除FB处理外，连作过程各施肥处理土壤细菌群落结构均发生变化；FB处理对连作前期土壤细菌群落结构有较大影响，并且在连作7茬后未发生明显变化。

进一步对上述处理土壤细菌遗传多样性指数进行计算。表3表明，與CK相比，有机、无机肥处理均能在短期内促进根际土壤细菌多样性及丰富度的提高，并且这种作用在不同肥料处理间存在差异；连作7茬后不同肥料处理土壤细菌多样性及丰富度均有不同程度下降甚至低于同期CK处理，FB处理下降程度相对小于FT及FC处理。

上述结果说明，连作导致土壤细菌群落结构发生明显变化，各施肥处理对连作不同时期土壤细菌群落结构产生不同程度的影响；从细菌多样性及丰富度上看，连作后对照处理呈增加趋势，而其他施肥处理均呈相反趋势，且连作7茬后土壤细菌多样性及丰富度呈现FB>FT>FC。

2.3不同施肥处理对黄瓜连作土壤中真菌群落结构及多样性的影响

依据不同施肥处理第1、7茬土壤真菌PCR-DGGE指纹图谱（图3-a），进行群落结构聚类分析（图3-b）。结果显示，相对于CK处理，不同施肥处理对同茬土壤真菌群落结构的影响存在差异，连作前期FT、FB处理对真菌群落结构的影响比FC处理更大，连作7茬后表现为FB>FT>FC；连作导致各施肥处理土壤真菌群落结构均发生变化；FT、FB处理对连作前期土壤真菌群落结构有较大的影响，但在连作7茬后对真菌群落结构的影响变小（图3）。

进一步对上述处理土壤真菌遗传多样性指数进行计算。结果表明，与CK处理相比，FC、FB处理均能在短期内促进根际土壤真菌多样性及丰富度的提高，而FT处理降低了根际土壤真菌的多样性及丰富度；连作7茬后不同肥料处理土壤真菌多样性及丰富度均有不同程度上升，但是均不高于同茬CK处理，FC处理上升程度相对小于FT及FB处理（表4）。

上述结果说明，连作导致土壤真菌群落结构发生明显变化，各施肥处理对连作不同时期土壤真菌群落结构有不同程度的影响。总体上，连作促进了施肥处理根际土壤真菌多样性及丰富度的上升，但与对照相比上升幅度较小；在连作7茬后土壤真菌多样性及丰富度表现为FB>FC>FT。

3结论与讨论

周宝利等认为，随着连作年限的增加，根际土壤中细菌和放线菌数量急剧下降，真菌数量显著上升[16-17]。马云华等研究发现，连作黄瓜土壤细菌和放线菌数量在5年前明显上升，5年后急剧下降，呈倒马鞍形变化[2]；真菌数量随连作年限的增加而增长，赵萌等的研究也有相似结果[18]。本试验结果表明，连作4年的黄瓜根际土壤中细菌、放线菌、真菌的数量均呈增加趋势。这与马云华等的研究结果[2，18]一致，而与周宝利等的研究结果[16-17]并不完全一致，其原因可能是由于种植作物种类不同、土壤基本性状不同[19]。与对照相比，单施复合肥使根际土壤真菌、放线菌的数量呈增加的趋势，而细菌的数量呈下降趋势；有机-无机肥的配施使根际土壤细菌、放线菌的数量总体呈增加趋势，而真菌的数量多数呈下降趋势，与单施化肥相比下降更明显。这与其他学者的研究结果[20]相似，说明相比化肥的单施，有机-无机肥的配施可以有效地降低黄瓜连作土壤中真菌与细菌比率，为作物提供更加良好的生长环境[21]。

土壤微生物群落结构的研究结果表明，不施基肥条件下（CK），连作增加了细菌及真菌的多样性，马宁宁等通过 PCR-DGGE技术对设施番茄连作土壤微生物群落结构及多样性的研究也证实了这一结果[21]；而吴凤芝等通过随机扩增多态性DNA（RAPD）技术研究设施黄瓜连作对微生物群落多样性的影响时发现，随着连作年限的增加，土壤细菌和真菌多样性及丰富度处于下降趋势[22]。本试验条件下得到的结果与吴凤芝等的结果[22]不一致，可能与以上2种分子生物学技术有关，当然土壤质地、肥力以及施肥等均会影响结果，有关方面还需进一步研究。

夏昕等认为，与对照相比，在红壤性水稻土壤中长期施用化肥降低了土壤细菌多样性，而长期施用无机-有机猪粪肥增加了细菌的多样性[23]。夏昕等对长期施肥条件下菜田土壤真菌多样性研究表明，与对照相比，无机-有机马粪肥的配施增加了真菌的多样性，而无机肥单施降低了真菌的多样性[24]。魏巍等在研究长期施肥对黑土农田土壤微生物群落的影响时发现，长期施用化肥降低了细菌和真菌的多样性，化肥配施有机猪粪肥降低了细菌多样性，却增加了真菌的多样性[25]。因为土壤类型是影响细菌的最主要因素，而土壤管理与施肥是影响真菌的最主要因素，上述试验的供试土壤基础养分对比显示，魏巍等试验用的土壤为典型黑土，有机质含量明显高于其他2种土壤，所以结果的差异可能与供试土壤的养分状况有关[25-26]。而本试验结果显示，连作条件下各施肥处理的土壤细菌与真菌多样性均低于CK处理，但无机肥配施微生物有机肥条件下土壤细菌和真菌的多样性与CK处理并没有显著差异。本试验供试土壤基础养分状况与魏巍等的试验土壤最为接近，所以细菌多样性与魏巍等的研究结果趋于相似，而施肥种类的不同可能导致了两者在真菌变化趋势上的差异[25]。

通过比较不同施肥处理对黄瓜连作土壤微生物区系以及细菌和真菌群落结构的影响可以看出，较其他施肥处理而言，微生物有机肥的连续施用能够使连作土壤中细菌多样性更为丰富，群落物种分布更为均匀，群落结构更为稳定；而对于真菌，无机-有机肥配施的2种处理都能够较好地稳定真菌的群落结构，但是化肥-微生物有机肥配施较化肥-普通有机肥配施能更好地提高土壤中真菌的多样性及丰富度。土壤微生物结构越稳定，多样性越丰富，物种分布越均匀，对病原菌拮抗能力就越强[27]。

综上所述，微生物有机肥与化肥（复合肥）的配施更有利于根际健康土壤细菌、真菌群落结构的构建。PCR-DGGE技术虽然具有重现性强、可靠性高、速度快等优点，但是它只能对微生物群落中数量大于1%的优势种群进行分析[28]，而且不同的DGGE试验条件也可能导致出现不同的指纹图谱，这对系统发育分析均有一定的影响。因此，仍需进一步应用高通量测序技术，更全面、详细地了解不同施肥处理对连作土壤中细菌、真菌的多样性及丰富度的影响。

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