张乘月

摘 要 小型动物透明骨骼标本是一种通过解剖学方法对动物体进行处理，并采用化学试剂使小动物肌肉变得透明，从而显现出被染色的动物骨骼的标本。作者通过一系列实验，摸索出制作透明骨骼标本的具体操作步骤，并从不同动物体的处理方式、制作过程中使用的化学试剂浓度、处理时间的调整、动物体差异等因素对于最终标本成品的影响进行了探讨，该方法可操作性强，为需要制作此类标本者提供了实际经验参考。

关键词 透明标本；小型动物；骨骼；化学试剂法

中图分类号 R3 文献标识码 A 文章编号 2095-6363（2017）17-0033-02

小型动物透明骨骼标本可以精确而直观地向我们展示动物体的骨骼形状和位置，犹如X光片一样。而分别用两种不同的染色剂进行浸泡的工艺，很自然地将硬骨和软骨用不同的颜色进行区分，是比X光片更加直观的展现方式。透明骨骼标本能为科学研究提供准确的骨骼结构，相比传统的剥制骨骼标本，能更精确地展现动物硬骨和软骨的原有位置。同时，制作得到的彩色标本非常具有美观性，并具有一定的市场价值。目前，有关这类标本的制作方法的文献较少，对于不同动物个体的实验条件有很多不确定性，有待进一步摸索经验和总结。笔者通过制作多批次金鱼、热带鱼、蛙和小鼠的标本，就各种因素对成品效果的影响进行了探讨，并总结出一种制备步骤相对比较简单、所需试剂较为易得、成品效果美观的方法。

1 化学试剂

无水乙醇，重铬酸钾，1%～2%氢氧化钾溶液，阿利新蓝，茜素红，冰醋酸，甘油，纯净水（去离子水或蒸馏水）。

2 制作步骤

1）对新鲜小动物尸体进行解剖学处理，将动物体剥皮，去除内脏及皮下脂肪，流水冲净，浸入无水乙醇中一周，以使动物体硬化。

2）浸入重铬酸钾（0.1mol/L）等溶脂质性溶液中约48h，以去除脂肪，倒回无水乙醇中浸泡约24h。

3）配制阿利新蓝在8倍体积的无水乙醇和2倍体积的冰醋酸中的饱和溶液，将动物体浸入其中约24h，从而为软骨染色。

4）用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液。

5）浸入约1%～2%氢氧化钾溶液中约4h～6h，以使肌肉呈半透明状态。

6）配制茜素红在无水乙醇中的饱和溶液，加入9倍体积的1%氢氧化钾溶液，浸泡动物体约48h，从而为硬骨染色。

7）用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液，浸入3%过氧化氢溶液，从而进行脱色。

8）使用升序梯度浓度的甘油溶液进行脱色，最后将标本浸泡在纯甘油中保存。

3 各种因素对骨骼标本制作的影响

3.1 解剖学处理方式对于骨骼标本成品效果的影响

对于一些体型较小（小于5cm）的鱼类及幼体蛙类，剥皮是可选步骤，并且既可以在开始制作前进行，也可以在第5步预透明之后进行，这两者间没有过大的差异，但去除鱼鳞是必要的。而对于体型较大的动物或有皮毛的动物（如成体小鼠），如果省略剥皮这一步骤，则会对最终的透明效果有较大影响。剥皮要尽量小心仔细，以减少对于肌肉和骨骼的损伤。

处理内脏的过程也与剥皮相似，只对于较大的动物体是必要的。这一步骤可以在第1步就进行，而对于热带鱼等体型较小的动物，则可以在第5步后使用注射器抽出，因为此时肌肉和各类组织已经变得柔软透明，比较容易进行加工。亦可以使用注射器吸取与第5步所使用的溶液相同浓度的氢氧化钾溶液，不断冲洗腹腔以去除内脏。

由于脑组织不能随肌肉一起变得透明，会在制作完成后使头部发黑，不能完全地显示头骨的形态，所以同样需要特殊处理，可以在第5步浸泡完成后用小镊子去除眼睛，将注射器伸进头骨，用氢氧化钾溶液不断冲洗头骨，以去除脑组织成分。

3.2 预透明步骤中氢氧化钾溶液浓度对于骨骼标本成品效果的影响

预透明步骤，也就是第5步，是整体制作过程中对于成品影響最大、也最难控制的一步。

首先，氢氧化钾溶液并不是一个标准的用量，需要根据动物体的大小和实际的操作情况进行调节，但这个浓度一般会掌握在1%～2%之间，浸泡时间长短也要根据实际情况随时调节。例如，实验证明，体长8cm的金鱼需要在1%氢氧化钾溶液中浸泡4h左右，而5cm左右的金鱼只需要浸泡3h左右；幼体青蛙如果不事先剥皮并处理皮下组织，会比较难透明，因此需要在2%氢氧化钾溶液中浸泡大约6h。

其次，对于温度的控制也十分重要，室内温度较高时可以相应的缩短这一步的时间，并保持标本体被置于阴凉处。非常重要的是，要时时观察标本体的状态，看到肌肉变得柔软并呈半透明状即可，过度进行此步骤可能导致在接下来的步骤中肌肉组织组织腐烂，不能支撑骨骼结构。另外，在此步骤以及后续步骤中，多个标本体可以在同一容器中进行制作，只要保证试剂没过标本即可，这样既可以节约时间又可以节约试剂成本。

3.3 两种染色剂对于骨骼标本成品效果的影响

从原理上来讲，阿利新蓝与软骨中的酸结合，而茜素红与硬骨中的钙结合，因此，并不是任何染色剂都能满足骨骼标本制作的需求。另外，这两种染色剂的使用也需要根据具体动物体的情况来决定。对于大多数动物，使用阿利新蓝的染色过程是一个可选步骤，因为茜素红已经能很好的显示硬骨的结构。而对于一些特殊的标本体，例如硬骨没有发育完全的幼体、以及鳐鱼等以软骨为主的动物，则应当使用阿利新蓝染色，以展现出其软骨组织的形态。

3.4 最终透明阶段所采用的试剂及其浓度对于骨骼标本成品效果的影响

如制作方法中的第8步所述，最后的透明阶段需要使用升序梯度浓度的甘油（丙三醇），详细地说，第一梯度是使用4倍体积的1%氢氧化钠溶液与1倍体积的甘油的混合溶液进行浸泡。在这一步骤中，理论上来讲是时间越长越好，一般浸泡一周左右，因为随着甘油浸入肌肉，肌肉组织会变得越来越透明。需要注意的是，千万不要因为急于使肌肉变得透明而企图加热浸泡的溶液，这同样适用于其他各个步骤，虽然加热确实能使液体对流，更加迅速地完成制作，但这会对标本体造成很大伤害，导致肌肉不能很好的将骨骼连接在一起。

在使用上述溶液浸泡一周之后，依次递阶更换成40%、60%、80%和100%浓度的甘油。要注意的是，较高浓度的甘油十分粘稠，很难对流，所以需要不时轻轻地上下颠倒混匀，在溶液均匀后（大约每个梯度浓度浸泡2天），即可更换成下一浓度，直到更换为100%的纯甘油。密封于玻璃瓶中，标本体可以在纯甘油中长期

保存。

3.5 个体差异对于骨骼标本成品效果的分析

通过对多次实验研究过程的观察，笔者发现，动物体的个体差异对于成品的最终效果有着很大的影响。

例如，同品种的小鼠之间皮下脂肪含量有很大差异，如果不经处理，会导致皮下脂肪较多的小鼠出现肌肉部分浑浊，并伴有乳白色的脂肪块，透明效果欠佳。此时就需要在剥皮时尽量去除皮下脂肪（又不能伤及肌肉和骨骼），或是使用溶脂性溶液（如重铬酸钾溶液等）进行浸泡。

再例如，同种热带鱼雄鱼和雌鱼之间的差异也不容小视，对于雌鱼腹内的鱼卵需要在预处理阶段用清水洗净，否则腹部将成为半透明状，影响透明效果。

4 成果

作者制作了多批次金鱼、热带鱼、青蛙幼体和小鼠的标本。这种标本的形式既能使动物体各个精细结构展露无遗，又能从多角度呈现立体的骨骼结构，方便观察，避免了传统的解剖取骨清洗再组装而导致的骨骼相对位置的改变。所制作的部分标本成品展示如下图所示。

5 结论

实验证明，对小动物体的处理方式、各个阶段所采用的试剂的浓度大小、浸渍时间长短、动物个体差异等因素都会对骨骼标本的成品效果会产生影响，甚至会使得制作批次的产品完全失败。制作透明骨骼标本的过程中不定因素非常多，需要我们细心观察制作过程中动物体的变化，及时调整实验条件，多次实验，总结经验、不断摸索恰当的实验条件。

参考文献

[1]李典友，高本刚.生物标本采集与制作[M].北京：化学工业出版社，2016：88-105.endprint