李 舸，刘晓霖，陈 锐，刘书华，李韵峰，关雅伦，李雪娇，裴 中，黄 韧，张 钰*

(1.广东省实验动物重点实验室，广东省实验动物监测所，广州 510663； 2.中山大学附属第一医院神经科，广州 510080)

研究报告

非人灵长类评价学习记忆功能的影响因素探讨

李 舸1，刘晓霖1，陈 锐1，刘书华1，李韵峰1，关雅伦1，李雪娇1，裴 中2，黄 韧1，张 钰1*

(1.广东省实验动物重点实验室，广东省实验动物监测所，广州 510663； 2.中山大学附属第一医院神经科，广州 510080)

目的基于威斯康辛通用测试仪的延迟应答测试是评价非人灵长类学习记忆能力的常用方法，该实验在进行过程中受到很多因素影响，如何设定规范的训练和评价参数，对正确评价猴的学习记忆能力具有重要的参考意义和价值。方法本研究选取8～9岁雄性食蟹猴作为实验研究对象，利用改良的威斯康辛通用测试仪检测，通过食蟹猴获取食物的正确率来评价训练次数，评价频率，间隔评价时间，延迟时间和陷阱食盒数量等实验因素对结果的影响。结果当减少训练阶段的训练次数(小于10次)时，食蟹猴获取食物的正确率不稳定且呈现出显著的下降趋势；在获得足够训练的前提下，评价频率对食蟹猴获取食物的正确率影响较小；常规训练后3个月进行评价，食蟹猴仍然能够获得65%的获取食物正确率；增加延迟时间后，会导致部分食蟹猴获取食物的正确率显著降低；此外，当增加到3个以上陷阱食盒时，导致食蟹猴获取食物正确率普遍低于65%以下。结论合理的设置训练和评价阶段的实验参数对非人灵长类学习记忆功能的评价具有重要的影响和意义。

非人灵长类；学习记忆；训练；评价

非人灵长类动物学习记忆测试是评价动物学习和记忆能力的重要方法之一，被广泛应用于神经生物学、神经疾病研究、神经相关治疗药物评价等。其中，基于上世纪30年代Harlow发明的威斯康辛通用测试仪(Wisconsin general testing apparatus，WGTA)的延迟应答测试被认为是评价非人灵长类学习记忆能力的常用方法，一直沿用至今[1]。在实验过程中，在测试仪器内设立多个陷阱食盒，并在其中一个陷阱食盒中放置奖励性食物，在一定时间内阻隔动物观察陷阱食盒后，考察动物获取奖励食物的正确率，进而评价动物的学习记忆能力。

该测试包括训练和测试两个阶段，其中，训练阶段主要是通过反复引导动物学习熟悉测试过程，降低非人灵长类动物个体的学习记忆能力差异对实验结果的影响，一般训练阶段设立2个陷阱食盒，通过设定一定延迟时间阻隔动物观察陷阱食盒，然后让动物自由选择，如果选择了具有食物奖励的应答位置，则被认为是正确应答，计算动物在该延迟时间下的正确应答率，从而评价其学习能力[2]。而测试阶段则通过设定合理的延迟时间或者增加陷阱食盒数量，实现对动物学习记忆能力的综合评价[3]。因此，本文将主要针对训练和评价阶段测试参数设置开展研究，规范非人灵长类实验动物学习记忆评价实验操作。

1 材料和方法

1.1实验动物

普通级8～9岁雄性食蟹猴14只，购买自广东春盛生物科技发展有限公司[SCXK (粤) 2014-0027]。食蟹猴饲养于广东省实验动物监测所普通级动物实验室 [12 h/12 h昼夜周期，湿度40%～70%，温度(21±2)℃] [SYXK (粤) 2016-0122]，动物每天饲喂2次，其中1次饲喂水果。本研究所涉及的动物实验获得广东省实验动物监测所(AAALAC认证机构)实验动物使用与管理委员会(IACUC)批准(IACUC2016006)，并符合中华人民共和国《实验动物管理条例》。

1.2仪器

猴学习记忆学习评价设备为在参考WGTA行为学测试笼具基础改装而成(图1)。猴笼前放置多个陷阱食盒，食盒深度2 cm，在食盒与猴笼之间有一可以自由升降的不透明隔板，食盒与实验员之间有一单向可视观察窗。实验开始时，实验员打开食物传递窗，根据每只食蟹猴对食物的喜好，在其面前将食物随机放在其中一个食盒内，盖上盒盖并迅速放下隔板，开始计时，在设定的延迟时间到达之后，升起隔板，让食蟹猴可以看见被盖上的食盒，食蟹猴可以选择一个食盒打开并从中获得食物，实验员记录该次测试中食蟹猴是否正确选择含有食物的食盒。

注：① 猴笼；② 食盒；③ 隔板；④ 观察窗；⑤ 食物传递窗。图1 猴学习记忆评价装置Note. ① Monkey cage; ② Stimulus trays; ③ Partition; ④ Window for observation; ⑤ Window for food delivery.Fig.1 The testing apparatus for evaluation of learning and memory ability of nonhuman primates

1.3实验方法

1.3.1 食蟹猴学习记忆能力训练和评价方法

每只食蟹猴必须由同一个实验员负责进行训练，以减少动物的应激反应。每只食蟹猴每天完成一个训练周期，每个训练周期由5个不同的延迟时间(A～E)组成，包括，A=N × 0=0 s，B=N × 1=1 N s，C=N × 2=2 N s，D=N × 3=3 N s，E=N × 4=4 N s，N为设定的基础值，以基础值设定为1为例，表示隔板在动物与食盒之间的延迟时间为0 s、1 s、2 s、3 s、4 s。每个延迟时间均进行5次训练实验，因此，每个训练周期共计进行25次训练。当天一个训练周期结束后，统计该食蟹猴在该训练周期25次训练中选择正确食盒的平均正确率，训练阶段选择食盒的平均正确率=训练阶段每天选择食盒的平均正确率之和/评价持续天数[4， 5]。

训练阶段完成后，根据实验设计要求，进入学习记忆评价阶段。评价阶段的基础值N根据实验要求选择，一般要求≥训练阶段的最高N值。与训练阶段相似，评价阶段每只食蟹猴每天完成一个训练周期，持续评价数天，或者增加陷阱盒用同样方法评价。

注：与训练阶段比较，*P< 0.05，**P< 0.01。图2 A组食蟹猴训练阶段与评价阶段的正确率比较Note. Compared with the training stage,*P< 0.05,**P< 0.01.Fig.2 Comparison of the correct rates between the training and evaluation stages of cynomolgus macaques in Group A

1.3.2 训练次数对食蟹猴学习记忆能力评价的影响

训练阶段14只雄性食蟹猴被分为2组，其中A组8只动物(动物编号：M232，M236，M237，M231，M235，M238，M230，M239)每天均完成一个训练周期，连续训练20 d，仪器内设置2个陷阱食盒，从基础值N=1(延迟时间为0 s，1 s，2 s，3 s，4 s)开始训练，当正确率达到65%以上，以基础值N为2进行训练，以此类推，直至基础值N设定为4，并维持该基础值直至20 d训练结束。训练结束后2个月，以基础值N=4进行评价，连续评价10 d，每天完成一个评价周期，对比训练与评价阶段的正确率差异。

B组6只动物(动物编号：M267，M269，M268，M270，M271，M233)每天均完成一个训练周期，连续少于或等于10 d，仪器内设置2个陷阱食盒，只以基础值N=1(延迟时间为0 s，1 s，2 s，3 s，4 s)进行训练。训练结束后2个月，以基础值N=4进行评价，连续评价10 d，每天完成一个评价周期，对比评价训练与评价阶段的正确率差异。

1.3.3 评价频率对食蟹猴学习记忆能力评价的影响

A组2只食蟹猴(M230，M239)分别在间隔1周和间隔2周后，以基础值N=4开展评价，探讨不同时间间隔对食蟹猴学习记忆能力的影响。

1.3.4 长时间间隔后对食蟹猴学习记忆能力评价的影响

A组2只食蟹猴(M230，M239)在训练结束后间隔3个月，以基础值N=4开展评价，探讨长时间遗忘对评价记忆能力的影响。

1.4统计学方法

2 结果

2.1训练次数对食蟹猴学习记忆评价的影响

A组8只食蟹猴在训练20次后均能在基础值N设定为4时(延迟时间0 s，4 s，8 s，12 s，16 s)，选择具有食物奖励的陷阱食盒的正确率达到65%以上(图2)。间隔2个月后，以基础值N为4开展评价发现，除编号为M231的食蟹猴外，其余食蟹猴在评价阶段的平均正确率与训练阶段相比均出现上升趋势，其中编号为M236和M237的食蟹猴正确率显著升高(P< 0.01)(图2)。

B组6只食蟹猴训练次数小于10次，并且训练阶段基础值N仅采用1(延迟时间0 s，1 s，2 s，3 s，4 s)，间隔2个月后，以基础值N为4开展评价发现，除编号为M269的食蟹猴平均正确率基本与训练阶段保持一致外，其它5只食蟹猴的平均正确率都出现显著降低(P< 0.05)(图3)，此外，编号为M233的食蟹猴已无法完成记忆评价试验。

2.2评价频率对食蟹猴学习记忆能力试验的影响

编号为M230和M239的食蟹猴分别采用每天评价一次，每周评价一次以及每两周评价一次的评价频率开展学习记忆能力评价，结果表明，分别选用3种评价频率开展评价，2只食蟹猴的正确率均能保持在65%以上，但编号为M239的食蟹猴延长评价频率开展评价导致正确率出现显著降低(P< 0.05)(图4)。

2.3食蟹猴训练后对学习记忆遗忘的影响

编号为M230和M239的食蟹猴，间隔3个月通过增加基础值N或增加陷阱盒对学习记忆能力进行评价。结果表明，间隔3个月，当以基础值N为4(延迟时间为0 s，4 s，8 s，12 s，16 s)进行记忆评价时，2只食蟹猴获取奖励性食物的平均正确率仍然维持在65%以上，而以基础值N为10(延迟时间为0 s，10 s，20 s，30 s，40 s)进行评价时，编号为M230的食蟹猴还能维持较好的平均正确率，但编号为M239的食蟹猴平均正确率显著下降(P< 0.01)(图5)。而在增加陷阱食盒的测试中，无论是增加到3个还是4个，2只食蟹猴的平均正确率都达不到65%(图6)。

注：A:训练阶段；B：间隔3个月N=4；C：间隔3个月N=10。与训练阶段比较，**P< 0.01。图5 增加基础值N对食蟹猴学习记忆能力评价的影响Note. A：The training stage;B:3-month interval，N=4;C:3-month interval,N=10.Compared with the training stage,**P< 0.01.Fig.5 Effect of increase of N value on evaluation of learning and memory ability of the cynomolgus macaques

注：A:3个陷阱食盒；B：4个陷阱食盒。图6 增加陷阱食盒对食蟹猴学习记忆能力评价的影响Note:A:3 trays;B:4 trays.Fig.6 Effect of increase of quantity of stimulus trays on the evaluation of learning and memory ability of cynomolgus macaques

3 讨论

当动物在做出某一正确行为后并获得奖励，大脑向负责决策的区域发送“奖赏”信号，从而促进动物的认知能力提升，形成良性循环，这被称作“奖赏效应”[6]。大脑的这一特点也为在动物上开展学习记忆能力评价成为可能[7]。由于非人灵长类实验动物个体在学习记忆能力上差异较大，因此，相比于使用在啮齿类上进行的各类标准化的学习记忆功能评价实验，利用非人灵长类开展学习记忆评价过程更为复杂且难度较大。

威斯康辛通用测试仪是进行非人灵长类动物学习记忆测试的金标准，训练是有效降低不同动物个体差异影响评价结果的重要手段，该阶段主要是使动物熟悉和适应测试环境和设备，使不同的动物通过训练后能够达到一定的标准，降低动物个体差异对评价测试的影响，考察动物的学习能力[8]。因此，合理的训练不仅能够减少动物个体差异对实验的影响，同时，能够有效地控制实验周期降低实验成本。因此，在本研究中，我们首先考察了训练次数对动物学习记忆评价的影响，我们发现当训练阶段的训练天数超过10 d时，即能够使动物在间隔2个月后进行的评价中达到较好正确率，当训练阶段训练天数低于10 d时，即使所有动物在训练阶段能够达到预设的65%以上的正确率，但动物在评价阶段的正确率均出现不同程度的下降，甚至有的动物根本无法完成评价，这表明较少的训练天数对最终的评价结果产生较大的影响，10 d训练可能是保证动物能够完成学习记忆能力评价的最低要求。

评价阶段主要是对动物记忆能力的考察，我们发现，评价频率对整个实验结果的影响较小，但是选择合理基础值N设置延迟时间是获得客观稳定的评价结果的关键因素，理论上在评价阶段N值可以随意设置，而在近年来的一些研究中，我们也发现不同的研究对于N值的选取存在较大差异[9-11]。在研究中我们发现，不同的食蟹猴在训练阶段达到规定的正确率后，间隔3个月进入评价阶段，在选择与训练阶段相同基础值N(延迟时间相同)下，食蟹猴选择食盒的正确率并未受到影响，但当评价阶段基础值N增加(延迟时间增加)到10时，不同的食蟹猴选择食盒的正确率呈现出较大差异，因此，在实际实验过程中，根据实验目的选择合理的基础值N对于评价结果至关重要。

在非人灵长类动物学习记忆能力评价中，目前大多数测试仍然是通过改变评价阶段的延迟时间获得评价结果，在本研究中，我们进一步探讨了训练与评价之间的间隔时间以及食盒数量设置对影响非人灵长类动物学习记忆评价的影响。在保证足够的训练，并且在评价阶段设置与训练阶段相同的延迟时间的前提下，我们发现，将训练与评价之间的间隔时间增加到3个月时，仍然能够将动物选择食盒的正确率维持在65%以上，但是，当我们在评价阶段将陷阱食盒数量增加后，却明显地降低了所有动物选择食盒的正确率，这种普遍性地降低可能主要是由于动物本身的学习记忆能力相关，并非动物个体差异造成，因此，增加陷阱食盒的方式可能并不适用于动物的学习记忆功能评价。

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Investigationofinfluencingfactorsontheevaluationoflearningandmemoryinnonhumanprimates

LI Ge1， LIU Xiao-lin1， CHEN Rui1， LIU Shu-hua1， LI Yun-feng1， GUAN Ya-lun1， LI Xue-jiao1， PEI Zhong2， HUANG Ren1， ZHANG Yu1 *

(1.Key Laboratory of Laboratory Animals in Guangdong Province, Institute of Laboratory Animal Monitoring in Guangdong Province, Guangzhou 510663, China； 2.Department of Neurology, The First Hospital Affiliated to SunYat-sen University, Guangzhou 510080)

ObjectiveThe delayed-response task based on the Wisconsin General Testing Apparatus (WGTA) is commonly used to evaluate the ability of learning and memory in nonhuman primates. Because the task may be influenced by a number of factors, how to set and standardize the parameters during the training and evaluation stage is of great significance and value for obtaining appropriate results of learning and memory ability.MethodsIn this study, 8～9 years old male cynomolgus macaques (Macacafascicularis) were tested with the modified WGTA. We evaluated the influence of experimental factors such as the times of training, frequency of evaluation, interval time of evaluation, delayed time and number of stimulus trays on the results of learning and memory ability in the macaques by investigating the correct rates of food acquiring.ResultsThe correct rate of food acquiring of the cynomolgus macaques was unstable and significantly decreased when the times of training was less than 10 during the training stage. The frequency of evaluation had less effect on the correct rate on the basis of enough training. The correct rate of food acquiring was still above 65% with a 3-month interval after training. However, the increase of delayed time led to significant decrease of the correct rate in some macaques. In addtion, more than 3 stimulus trays also resulted in a low correct rate in general less than 65%.ConclusionsReasonable designing of the experimental parameters during the training and evaluation stage is important for determining the learning and memory ability in nonhuman primates.

Nonhuman primates; Learning and memory; Training; Evaluation

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0024-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.005

2017-06-29

广东省科技计划项目(编号：2014B040404053，2015A020212027)。

李舸(1983-)，男，博士，研究方向：神经退行性疾病动物模型及机制研究。E-mail: gonanlee@gdlami.com

张钰(1970-)，女，研究员，研究方向：神经退行性疾病动物模型及机制研究。E-mail: zhy@gdlami.com