朱贝贝 （山东省即墨市海洋与渔业局 266200）

方 皓 李 煜 吴佳燕 王雪鹏* （山东农业大学动物科技学院 山东 泰安）

文蛤病原菌哈氏弧菌的分离鉴定与药敏试验

朱贝贝 （山东省即墨市海洋与渔业局 266200）

方 皓 李 煜 吴佳燕 王雪鹏*（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安）

本文从山东某文蛤养殖区发病的文蛤体内分离鉴定出一株哈氏弧菌，本研究对该菌形态、生理生化特征、16SrDNA及致病性进行了初步分析，在NCBI上比对结果显示该菌为哈氏弧菌。人工感染健康的文蛤，该菌能引起文蛤发病的，死亡率高达80%，且发病症状与养殖区文蛤的发病症状相同，由此表明，该菌是引起文蛤发病的病原菌。该菌对对18种药物有不同程度的耐药性。对萘定酸、氯霉素表现为高度敏感，哌拉西林、复方新诺明表现为敏感，庆大霉素为中度敏感，阿莫西林表现为耐药。

文蛤 哈氏弧菌 16SrDNA 药敏试验

文蛤(Meretrix meretrix)是我国沿海重要的经济贝类，是我国沿海开发滩涂、发展贝类养殖的理想对象，具有广阔的市场前景和较高的经济价值。与其他养殖贝类一样，文蛤养殖产业也正在面临着病害带来的负面影响，造成了较为严重的经济损失。弧菌是导致文蛤发病的主要致病菌之一。本研究对发病的文蛤中的优势菌株进行分离鉴定，并进行人工感染和药敏试验，深入分析文蛤致病菌，为文蛤养殖提供参考依据，合理用药，避免更多的损失。

1 材料与方法

1.1 发病文蛤 于2016年8月份在山东沿海某文蛤养殖区域，文蛤发病高峰期，采集病状特征明显、濒临死亡的文蛤。患病文蛤，解剖发现外套膜萎缩，闭壳肌松弛、开合无力，有些发烂发白，软体部消瘦，颜色淡红，血管无色，部分发病文蛤的腮黏液明显增多。

1.2 细菌分离 无菌水冲洗文蛤表面的泥沙，用70%的酒精棉球对体表擦拭消毒，无菌镊子和剪刀开启外壳，取肝胰脏等部位无菌匀浆器中匀浆处理，zobell 2216E平板和TCBS平板划线接种，28℃培养12h后，选取优势菌落进行重复划线纯化，纯培养物于4℃冰箱中保存。

1.3 人工感染试验 人工感染试验在20L水族箱中进行，设置条件为温度28℃，盐度26.4，pH8.2，连续充气。实验设置三个试验组，一个对照组。每组放15只3cm大小的健康文蛤。每天换水1次，试验组调节水体中细菌浓度为108cfu/ml，每日投单胞藻1次；对照组不加入菌体，按上述方法饲养；连续观察12d，纪录死亡状况，并对死亡文蛤进行解剖和病原的再分离，以确定是否死于攻毒活菌引起的感染。

1.4 细菌生化鉴定 按一般细菌常用鉴定方法进行分离菌的生物学性状测定，包括革兰氏染色、形态观察、生理生化特性测定(所用试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.5 16SrDNA克隆、测序 采用细菌16SrDNA序列扩增的通用引物对纯化培养的细菌16S rDNA序列进行PCR扩增。上游引物为5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，下游引物为5'AAGGAGGTGWTCCARCC-3'(引物由上海生工生物工程有限公司合成)。所得PCR产物经纯化后送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.6 药敏试验 采用纸片琼脂扩散法，在TCBS选择培养基上28℃培养12h，测量抑菌圈直径。药敏纸片购自杭州

天和微生物试剂有限公司。

2 结果与分析

2.1 细菌形态特征 在TCBS弧菌固体选择培养基上生长，28度温箱中培养12h，菌落为黄色(图1)。该菌经革兰氏染色后在光学显微镜下观察，为革兰氏阴性菌，菌体短小，长约2～3µm，有的弧菌有一定的弯曲，呈弧状或逗点状(图2)。无芽胞和荚膜。

图1 细菌在TCBS培养基上的生长特性

图2 细菌革兰氏染色照片

2.2 人工感染试验 人工感染2d后，文蛤开始出现病态，5d后开始出现死亡，10d后试验组不再出现死亡，病死率为80%。于是初步判定2016年8月山东某养殖区文蛤大批死亡主要是以该分离菌为主要病原体的传染病所造成。2.3 分离菌株生化特性 细菌生化特性结果见表1。

表1 细菌生化特性

2.4 16SrDNA克隆、测序 对2-1菌株16S rDNA序列进行进化树分析PCR扩增，如图3所示，进一步证实该菌为哈氏弧菌。

图3 细菌进化树分析结果，图中2-1.seq表示分离株

2.5 药物敏感试验 药物的敏感性根据抑菌圈直径大小来判断，抑菌圈直径大于20mm为高度敏感；15.1～20mm为敏感；10.1～15mm为中度敏感；10mm以下为低度敏感；无抑菌圈为耐药。

表2 药物抑菌圈直径 (mm)

根据试验结果显示，哈氏弧菌对18种药物有不同程度的耐药性。对萘定酸、氯霉素表现为高度敏感；环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、四环素、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、复方新诺明表现为敏感；阿米卡星、庆大霉素、多西环素、头孢噻吩、头孢呋辛表现为中度敏感；氨苄西林，阿莫西林表现为耐药。

3 讨论

（1）哈氏弧菌感染海水养殖动物的报道比较多，但导致贝类病害发生的报道却很少。本次样品采集是在高水温期，表明哈氏弧菌是容易在高温环境下生长并导致海水养殖动物的弧菌病，通过人工感染实验可知，感染后的试验文蛤出现明显的病症：表皮部分脱落、表面粘液较少，解剖发现外套膜萎缩，闭壳肌松弛、开合无力，有些发烂发白，软体部消瘦，颜色淡红，血管无色，部分患病文蛤腮黏液明显增多，死亡率高达80%，从浸泡感染方式发病文蛤处分离到与自然发病相同的细菌，因此可以确定该分离株是文蛤发病的病原体。（2）从药敏试验结果来看，该菌对萘定酸、氯霉素表现为高度敏感；环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、四环素、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、复方新诺明表现为敏感；阿米卡星、庆大霉素、多西环素、头孢噻吩、头孢呋辛表现为中度敏感；氨苄西林，阿莫西林表现为耐药。因此在疾病发生时可以适量投放一些抗菌性药物，但值得注意的是目前在养殖过程中误用、滥用抗生素和消毒剂等，影响了水体中微生态环境的平衡，可能导致了一些耐药菌株的出现，但是合理选择和使用有效的抗生素仍是目前和近期内控制疾病主要方法。为了更好的预防病害发生，塘养或池养文蛤(滩涂除外)可以适量投放微生态制剂，如芽孢杆菌和光合细菌，以达到生态防治的目的。

[1] 张晓君, 毕可然, 阎斌伦. 中国对虾糠虾幼体病原哈氏弧菌的鉴定及毒力基因检测[J]. 渔业科学进展, 2014, 35(3): 105-111.

[2] 张晓君, 房海陈, 翠珍. 致病性哈氏弧菌生物学及分子特征[J]. 中国兽医学报, 2009, 29(9): 1120-1124.

[3] 石亚素, 童国忠, 薛超波. 舟山养殖大黄鱼烂尾病中哈氏弧菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(3): :267-269.

[4] 吴后波, 潘金培. 弧菌属细菌及其所致海水养殖动物疾病[J]. 中国水产科学, 2001, 8(1): 89-93.

[5] 张晓君, 秦国民, 阎斌伦. 病原哈氏弧菌对20种中草药的敏感性测定及分析[J]. 江苏农业科学, 2009, 2: 214-216.

[6] Duplication ofhemolysin genes in a virulent isolate ofVibrio harveyi. Zhang X H, Meaden P G, Austin B. Appl En-viron Microbiol . 2001.

[7] Zhang X H,Meaden P G,Austin B.Duplication of he-molysin genes in a virulent isolate ofVibrio harveyi[J]. Appl Environ Microbiol, 2001, 67: 3161-3167.

S945.1+9

A

1007-1733(2017)09-0004-02

2017–04–13）

山东省现代农业产业技术体系贝类创新团队项目（SDAIT-14-07）*通讯作者