李想　马宏达　吴琼

[摘要] 目的 建立肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中抗Xa因子效价的测定方法。 方法 对肝素钠肌醇烟酸酯乳膏进行破乳处理后，采用微量生色底物法、生物检定统计法，测定乳膏中抗Xa因子的效价。 结果 建立了肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中肝素钠抗Xa因子的测定方法，抗Xa因子在0.0250～0.1020 IU/mL范围内与吸光度（A）值线性关系良好（r=0.996）；低、中、高浓度的平均回收率为99.5%，RSD为1.92%（n=9）。抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效价比值在0.9～1.1范围内。 结论 该方法结果准确，重复性好，可用于肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中抗Xa因子效价的测定，有效控制该制剂的质量。

[关键词] 微量生色底物法；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏；抗Xa因子；效价

[中图分类号] R961 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（a）-0030-03

[Abstract] Objective To establish a method for determination of anti-FXa potency in heparin sodium and inositol nicotinate cream. Methods The emulsion was broken. The anti-FXa potency was determined by micro-chromogenic substrate method and biological test statistics method. Results The determination method was established for anti-FXa potency in heparin sodium and inositol nicotinate cream. The linear range of anti-FXa was during 0.0250-0.1020 IU/mL （r=0.996）. The average recovery in three levels was 99.5% （RSD=1.92%， n=9）. The ratio of potency was during 0.9-1.1 for anti-FXa and anti-FⅡa. Conclusion The method is accurate and reproduceable. It can be used for the determination of anti-FXa potency in order to control the quality of heparin sodium and inositol nicotinate cream.

[Key words] Micro-chromogenic substrate method； Heparin sodium and inositol nicotinate cream； Anti-FXa； Potency

凍伤是指机体长时间暴露于寒冷环境，导致全身或局部体温下降而产生的损伤[1-2]。轻度冻伤，主要损伤皮肤、肌肉[3]，重度冻伤损伤肌肉和骨，甚至导致残废、危及生命[4-5]。沈阳军区总医院研制的肝素钠肌醇烟酸酯乳膏，防治冻伤效果显著。该制剂由肝素钠和肌醇烟酸酯组成[6]，通过扩张血管、改善微循环，使局部血流通畅，以消除冻伤部位红肿、疼痛等症状。肝素钠为硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属于多糖类物质[7-8]，肝素钠与抗凝血酶Ⅲ结合，对凝血因子Ⅱa和Xa等具有抑制作用[9]，是临床应用最广泛的抗凝药物之一[10-11]。准确测定肝素钠抗Xa因子效价、测定抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效价比，既保证了有效性，又提高了安全性。在此前的研究中，课题组建立了乳膏中抗Ⅱa因子的效价测定方法[12]。本文采用微量生色底物法，测定抗Xa因子效价，方法准确、重复性好，可有效控制制剂质量，更好地服务于临床。

1 材料与方法

1.1 仪器

120D型电子分析天平（北京岛津公司）；电热恒温水浴锅（天津泰斯特公司）；ELX800型酶标仪（BIO-TEX instruments，INC）；生物检定统计程序BS2000（中国食品药品检定研究院编制）。

1.2 试药

肝素钠肌醇烟酸酯乳膏（沈阳军区总医院，规格：20 g：8000 IU；批号：20141113、20150108、20150109）；肝素钠标准品（USP，9.5 mg-2144 IU）；抗凝血酶Ⅲ（Chromogenix，10 IU/瓶）；发色底物S-2765（Chromogenix，25 mg）；Xa因子（Chromogenix，71 nkat/支）；三羟甲基氨基甲烷、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸二钠均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 标准品溶液（S）：精密称取肝素钠标准品适量，加灭菌注射用水制成1 IU/mL的溶液，再加缓冲液稀释成浓度为0.0350、0.0500、0.0714、0.1020 IU/mL的标准品溶液，相邻剂量组的浓度比值为1∶0.7。

供试品溶液（T）：取乳膏约2 g，精密称定后加70%乙醇30 mL，置水浴上溶解，超声30 min，放冷后移至200 mL量瓶中，加0.9%氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀后置4℃冰箱过夜，取出滤过，取续滤液50 mL，置水浴上蒸发至无乙醇臭，移至50 mL量瓶中，用0.9%氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，配制与标准品溶液相当的4个系列浓度溶液。

阴性样品溶液：按处方量制备不含肝素钠的乳膏，按“供试品溶液”配制方法制成阴性样品溶液。

三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH 8.4）：即空白溶液（B），取三羟甲基氨基甲烷6.06 g，氯化钠10.23 g，乙二胺四乙酸二钠2.80 g，聚乙二醇6000 1.0 g，加蒸馏水800 mL使溶解，用盐酸调节pH值至8.4，用蒸馏水稀释至1000 mL。endprint

抗凝血酶溶液：精密称取抗凝血酶Ⅲ适量，加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液溶解制成1 IU/mL的抗凝血酶Ⅲ溶液。

Xa因子溶液：精密称取Xa因子适量，加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液溶解并稀释制成0.4 IU/mL（7.1nkat）的溶液。

发色底物溶液（S-2765）：精密称取发色底物适量，加蒸馏水溶解使成0.001 mol/L的溶液。

终止液：取25 mL冰醋酸加水至50 mL，制成50%（v/v）醋酸溶液。

1.3.2 抗Xa因子效价的测定 效价测定前，进行空白调节：以空白溶液（B）代替供试品溶液测定抗Xa因子效价，调整Xa因子溶液的浓度，使空白溶液在405 nm波长处的吸光度（A）值在0.8～1.0范围内。

分别取5 μL标准品溶液（S）、供试品溶液（T）及空白溶液（B），按浓度梯度顺次加入到96孔板中（B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2），加入20 μL三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液，再加入25 μL的抗凝血酶Ⅲ溶液，混匀，37℃保温2 min。每孔各加Xa因子溶液50 μL，混匀，37℃保温2 min，再加入发色底物溶液（S-2765）50 μL，混匀，37℃保温2 min，最后各孔加入终止液50 μL终止反应。在405 nm波长处测定各孔的A值。应用生物检定统计程序BS2000、按生物检定统计法中的量反应平行线原理4×4法，计算效价及实验误差。平均可信限率（FL%）不得>10%。

2 方法学考察

2.1 专属性考察

取相同浓度的标准品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液及空白溶液，于405 nm波长处测定A值。结果表明，阴性样品溶液与空白溶液的A值无显著差异，不干扰供试品测定，专属性良好。

2.2 标准曲线的绘制

取1 IU/mL的肝素钠对照品溶液，加缓冲液稀释成浓度为0.0250、0.0350、0.0500、0.0714、0.1020 IU/mL的标准溶液，分别取25 μL加入至96孔板中，其他按“1.3.2”测得A值，以A值为纵坐标，标准溶液的浓度（C）对数值为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=-0.6361LogC-0.2614，r = 0.996。结果表明，样品浓度在0.0250～0.1020 IU/mL范围内线性关系良好。

2.3 回收率试验

精密称取处方量80%、100%、120%的肝素钠标准品各3份，按处方制备乳膏，按“1.3.1”制备供试品溶液，依法测定效价，计算回收率。平均回收率为99.5%，RSD为1.92%（n=9）。

2.4 精密度试验

取效价为0.05 IU/mL对照品溶液，测定在405 nm波长处的A值，同时测定6份，计算得RSD为1.75%（n=6），精密度良好。

2.5 重复性试验

取同批次样品6份，按“1.3.2”测定效价。结果表明，肝素钠抗Xa因子活性均值为407 IU/g，RSD為1.82%（n=6），重复性良好。

2.6 样品抗Xa因子效价测定

取3批肝素钠肌醇烟酸酯乳膏样品，制备供试品溶液，按“1.3.2”测定效价，并计算抗Xa因子与抗Ⅱa因子效价的比值，结果见表1。

3 讨论

传统的肝素钠效价测定方法是血液凝固法，虽然能间接反映抗凝活性，但是专属性不强[13-15]。据文献报道[16]，应用体积排阻色谱法测定抗Xa因子的活性，准确性和精密度高，但色谱柱成本高，且不适于乳膏剂。《中国药典》2015年版收载的肝素钠效价测定方法[17]，由2010年版的血液凝固法的修订为生色底物法[18]，但未明确试剂加入量等反应条件。本研究采用微量生色底物法，在96孔板上加酶反应试剂，用酶标仪测定抗Xa因子效价。微量生色底物法较血液凝固法减少了人为因素，提高了专属性、准确性和精密度；较生色底物法减少了酶反应试剂的用量，节约成本，可同时测定多个样本，显著提高了实验效率。

抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效价比与肝素钠诱发的潜在出血和血小板减少症等有关[9]。《中国药典》2015年版要求两者的效价比应为0.9～1.1[17]。本研究测定肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效价比，均在限定范围内，可用于肝素钠肌醇烟酸酯乳膏的质量控制。

在实验操作的过程中，微量酶反应需注意以下几点[19-20]。保证微量移液器的平行操作，以免影响精密度；严格控制酶反应时间及温度，保证试剂活性，使反应完全；因终止液具有挥发性，为保证各孔的反应同步，应尽量加快操作速度。

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（收稿日期：2017-04-25 本文编辑：李亚聪）endprint