石洪超　欧慧瑜　何风雷

[摘要] 目的 研究舒筋健腰丸对坐骨神经痛大鼠的坐骨神经组织病理改变以及血清中细胞因子的影响。 方法 选取112只SD大鼠，随机分为假手术组，模型组，壮骨关节丸组，芬必得酚咖片组，舒筋健腰丸高（4.38 g/kg）、中（2.19 g/kg）、低（1.10 g/kg）剂量组，每组16只。通过钝性分离，暴露大鼠右下肢坐骨神经并对其进行4道结扎，制备坐骨神经痛模型。假手术组只暴露坐骨神经但不结扎坐骨神经。造模成功后，连续灌胃给药28 d。末次给药后，检测各组大鼠的缩爪潜伏期，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的含量及坐骨神经组织的病理学改变。 结果 与假手术组相比，模型组大鼠缩爪潜伏期明显缩短（P < 0.05），坐骨神经发生水肿和空泡变性，血清中IL-1β、IL-6含量显著升高（P < 0.05）。与模型组相比，舒筋健腰丸组缩爪潜伏期延长（P < 0.05），坐骨神经病的变程度减轻，血清中炎性因子IL-1β、IL-6含量下降（P < 0.05）。 结论 舒筋健腰丸能明显减轻坐骨神经组织学改变，抑制炎性因子表达，对损伤性神经痛具有治疗作用。

[关键词] 舒筋健腰丸；坐骨神经痛；细胞因子；组织病理

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（a）-0011-05

[Abstract] Objective To study the effect of Shujin Jianyao Pills on the pathological changes of ischiadic nerve and cytokine in the serum of CCI （chronic constriction injury） rats. Methods 112 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， Zhuanggu Guanjie Pill group， Paracetamol and Caffeine Tablets group， Shujin Jianyao Pill low dose group （1.10 g/kg）， middle dose group （2.19 g/kg） and high dose group （4.38 g/kg）， with 16 rats in each group. The right common sciatic nerve was exposed by blunt dissection， and four ligatures were tied loosely around the sciatic nerve. Sham operation referred to the procedure of exposing the nerve as above but without any nerve ligation. All groups were administrated with corresponding drugs by intragastric administration once a day for 28 days. After the last administration， the hindpaw withdrawal latency （HWL） of the rats， the contents of inflammatory cytokines including TNF-α， IL-1β， IL-6， PGE2 in the serum and the pathological changes of ischiadic nerve were detected. Results Compared to the sham operation group， in the model group， the HWL was shortened， ischiadic nerve was become swollen and vacuolar， the serum levels of IL-1β and IL-6 were increased （P < 0.05）. Compared to the model group， in the Shujin Jianyao Pill groups， the HWL were extended， the pathological changes were ameliorated induced by CCI， and the IL-1β and IL-6 levels were decreased （P < 0.05）. Conclusion Shujin Jianyao Pill can alleviate the histologic changes of sciatic nerve， inhibit the expression of inflammatory cytokines， which has therapeutic effect on traumatic neuralgia.

[Key words] Shujin Jianyao Pill； Sciatica； Cytokine； Histopathology

神經病理性疼痛是由外力损伤或疾病侵袭神经系统引起的复杂慢性疼痛。持续的神经痛可影响患者的生理和精神状态，导致患者出现抑郁和焦虑等情绪障碍，严重时可导致患者出现自杀倾向，对社会的危害极其严重[1-2]。迄今为止，神经痛的发病机制仍不清楚，研究神经痛的发病机制和开发有效的治疗方法是目前迫切需要解决的问题。慢性压迫性坐骨神经损伤（CCI）模型能模拟神经痛部分临床症状，可用于神经痛发病机制的研究和治疗神经痛的药物筛选[3-4]。endprint

目前，针对神经痛的治疗，仍以非甾体抗炎药（NSAIDs）、抗抑郁药或吗啡类药物为主，仅对部分患者有效，但是存在副作用大的缺点。中医药是我国传统医学的瑰宝，在治疗一些慢性复杂疾病方面具有独特的优势[5-8]。舒筋健腰丸是陈李济药厂的独家中药品种，具有补益肝肾，强健筋骨，驱风除湿，活络止痛的功效。多年来临床用于治疗坐骨神经痛，效果良好。据报道，舒筋健腰丸具有较好的抗炎镇痛作用[9-10]，但是舒筋健腰丸对CCI诱导的神经痛是否具有缓解作用，仍需要进一步的研究。本研究拟建立大鼠CCI神经痛模型，采用行为学、ELISA、HE染色等方法，考察舒筋健腰丸对大鼠神经痛的影响，并通过与已上市药品进行比较，为临床研究与应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

112只SD大鼠（180～220 g），SPF级，雄性，4周龄，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。实验动物合格证号：SCXK（湘）2013-0004；饲养环境：每天12 h照明/12 h黑暗交替，温度（24±2）℃，相对湿度50%～60%，自由摄食和饮水。动物实验的操作步骤均得到广州医药研究总院有限公司药物非临床评价研究中心动物伦理委员会的批准。

1.2 药品及试剂

舒筋健腰丸粉（批号：16330），广州白云山陈李济药厂有限公司；壮骨关节丸（批号：1511003S），华润三九医药股份有限公司；芬必得酚咖片（批号：16010448），中美天津史克制药有限公司；戊巴比妥钠（批号：120505），德国默克公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号：E-EL-R0019c）、白介素-1β（IL-1β，批号：E-EL-R0012c）、白介素-6（IL-6，批号：E-EL-R0015c）、前列腺素E2（PGE2，批号：E-EL-R0034c）ELISA检测试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.3 仪器

Elx800酶标仪，美国Bio Tek公司；BX53生物显微镜和DP73荧光显微镜，CellSens Standard病理图像分析系统，日本Olympus公司；3-18k高速冷冻离心机，德国Sigma公司；ASP 300全密封自动脱水机，德国Leica公司；SW-CJ-2FD净化工作台，苏州净化设备有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠CCI模型制备及给药 适应性喂养1周后，将112只SD大鼠按照体重随机分为假手术组和造模组，其中假手术组16只，其余动物皆为造模组，参照文献[11]描述的方法，制备CCI模型。每只动物均给予2%戊巴比妥钠（3 mL/kg）麻醉，麻醉后剃去动物右下肢皮肤的毛，麻醉动物俯卧位固定，碘酒消毒，剪开右下肢皮肤，逐层分离皮下脂肪、浅筋膜，钝性分离股二头肌，使坐骨神经主干暴露在视野内，用玻璃分针挑出坐骨神经主干，对其进行4道结扎（结扎线采用4-0医用羊肠线），每道结扎的间距约为1 mm（结扎程度以切口暴露周围的肌肉产生轻微、短暂的抽搐为准），用0.9%氯化钠注射液冲洗切口，结扎后对肌肉和皮肤逐层进行缝合，缝合前后均在伤口处给予0.2 mL的青霉素钠注射液，以防感染。假手术组动物仅暴露坐骨神经但不结扎，其余操作方法与上述描述相同。造模第7 d对动物进行机械刺激回缩反应测定，与造模前相比，出现明显回缩反应的动物即为造模成功的动物，可进行后续实验，否则就从整体实验中剔除。所有模型大鼠动物均造模成功，将模型大鼠随机分为模型组（0.5% CMC-Na溶液），壮骨关节丸组，芬必得酚咖片组，舒筋健腰丸高、中、低剂量组，每组16只。造模第8 天開始对各组动物进行灌胃给药，除芬必得酚咖片组动物连续给药5 d，间隔2 d给药1次外，余下各组动物均每天1次，连续给药28 d（各组动物的给药体积均为10 mL/kg）。

1.4.2 热痛觉过敏测定 将大鼠放入辐射热刺痛仪的有机玻璃格子中，安静环境中适应20 min后，用强光照射大鼠脚掌中部皮肤，测定大鼠的缩爪潜伏期，每隔10 min测1次，取3次测定结果的平均值作为测定结果。为防止大鼠脚底被热辐射烫伤，将潜伏期的上限值定为30 s。

1.4.3 标本采集与病理检查 用20%乌来糖皮下注射麻醉，采用腹主动脉采血5 mL，3000 r/min离心15 min取上层血清，-20℃保存待测。坐骨神经标本的处理：每组选取8只，于大鼠造模侧损伤部位神经取两段组织，分别为结扎区域及距离结扎区域2.5～3.0 cm的结扎神经，放入10%甲醛溶液固定，经脱水、常规石蜡包埋制片及HE染色封片，光镜检查。组织学改变程度用-、+、++、+++表示正常、轻度、中度和重度。水肿发生率=出现水肿例数/总动物数×100%，空泡变性发生率=出现空泡变性例数/总动物数×100%。

1.4.4 细胞因子的检测 采用ELISA 试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的水平。

1.5统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Student-t检验；计数资料用率表示，等级资料比较采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 舒筋健腰丸对CCI模型大鼠缩爪潜伏期的影响

与假手术组相比，模型组动物的缩爪潜伏期显著缩短，差异有统计学意义（P < 0.05）。与模型组相比，舒筋健腰丸高、中、低剂量组可以显著延长模型大鼠的缩爪潜伏期，而且高剂量组的效果优于中剂量组和低剂量组（P < 0.05）。见表1。

2.2 舒筋健腰丸对CCI模型大鼠坐骨神经组织病理改变的影响

假手术组动物坐骨神经周围间质及神经纤维结构完整，排列整齐，未见异常变化；与假手术组相比，模型组动物均可见细胞质内可见多数空泡，细胞核排列不规则，并可见许多肥大细胞，为坐骨神经空泡变性（图1）。与模型组比较，壮骨关节丸组、芬必得酚咖片组、舒筋健腰丸高剂量组、中剂量组、低剂量组坐骨神经水肿、空泡变性程度降低（P < 0.05）。见表2。endprint

2.3 舒筋健腰丸对CCI模型大鼠血清炎性因子的影响

结果显示，与假手术组相比，模型组动物血清中IL-lβ、IL-6、TNF-α和PGE2含量显著升高（P < 0.05）；与模型组比较，壮骨关节丸组、芬必得酚咖片组、舒筋健腰丸高、中剂量组IL-lβ和IL-6含量均有不同程度的下降（P < 0.05）；TNF-α、PGE2差异无统计学意义（P > 0.05）。其中，舒筋健腰丸高剂量组IL-lβ和IL-6含量低于中低剂量组（P < 0.05）。

3 讨论

神经病理性疼痛是一种临床常见的慢性疼痛，其在人群中的发病率约为7%，中国约有1600万例神经病理性疼痛患者。患者常伴有抑郁、焦虑和睡眠障碍等症状，严重影响患者的生活质量，也给患者的家庭和社会带来巨大的经济负担[12-13]。因此，寻找治疗神经病理性疼痛的药物受到越来越多的关注。CCI是一种周围神经损伤导致神经痛的经典模型，与其他模型相比，具有显著的痛觉过敏现象，症状可持续8周以上[14]。本研究选用CCI大鼠模型来研究舒筋健腰丸对神经痛的作用。结果显示，在热痛觉过敏测定中，舒筋健腰丸可延长CCI模型大鼠的缩爪潜伏期，改善大鼠的痛觉过敏行为，并呈现一定的量效关系。

周围神经损伤后，伤害性刺激从外周传入中枢，胶质细胞上的危险相关分子模式感知这些信息后会引起胶质细胞激活并释放大量的促炎性细胞因子如IL-lβ和TNF-α等，导致脊髓内发生炎性反应[15-16]；神经炎性反应使传递痛觉的神经元兴奋，促进中枢敏化形成，在行为上则表现为痛觉过敏等现象[17-18]。外源性给予IL-lβ可诱导大鼠出现明显的热痛过敏[19]，而阻断中枢的IL-lβ信号可以缓解周围神经损伤引起的神经痛[20]。因此，神经炎性反应在神经病理性痛的形成中起着关键作用。在本研究中，模型组与假手术组相比，血清内IL-lβ、IL-6、TNF-α和PGE2水平明显升高（P < 0.05）。而与模型组相比，给予舒筋健腰丸28 d可以显著降低模型大鼠血清内IL-lβ和IL-6水平（P < 0.05），虽也能降低TNF -α和PGE2的水平，差异无统计学意义（P > 0.05）。对大鼠坐骨神经组织的病理学检查也发现，连续28 d给予舒筋健腰丸可减轻CCI引起的神经水肿和空泡变性等现象，从而发挥保护坐骨神经的作用。

综上所述，舒筋健腰丸能明显缓解CCI模型大鼠坐骨神经组织的病理变化，降低血清内炎性因子的含量，从而改善模型大鼠的热痛过敏行为。提示舒筋健腰丸对坐骨神经痛具有明确的治疗作用。在后续的实验中，将进一步研究其具体的作用靶点，为舒筋健腰丸临床的应用提供科学依据。

[参考文献]

[1] Jay GW，Barkin RL. Neuropathic pain：etiology，pathophysiology，mechanisms，and evaluations [J]. Dis Mon，2014， 60（1）：6-47.

[2] 倪雪珺，杜冬萍.神经病理性疼痛与抑郁和焦虑精神症状的相关性[J].上海交通大学学报：医学版，2013，33（1）：67-70.

[3] Savastano LE，Laurito SR，Fitt MR，et al. Sciatic nerve injury：a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery [J]. J Neurosci Methods，2014，227：166-180.

[4] 彭晴，劉涛，余昌胤，等.淫羊藿次苷Ⅱ对大鼠坐骨神经损伤后功能恢复和神经再生的影响[J].中国医药导报，2016，13（5）：12-16.

[5] 冯慧琼，董峰.人参皂苷Rg1促进坐骨神经损伤后修复的研究[J].中国现代医生，2016，54（14）：27-30.

[6] 冯峰，邹庆玲.中药治疗糖尿病周围神经病变临床疗效观察[J].中华中医药学刊，2014，32（8）： 2008-2013.

[7] 唐萌芽，翁祝承， 邵利芳.中药治疗膝骨关节炎临床疗效和安全性的系统评价[J].中医正骨，2014，26（1）：43-48.

[8] 严红梅，张振海，孙娥，等.中药治疗骨质疏松症的研究进展[J].中草药，2014，45（8）：1174-1178.

[9] 谢琳，吴启富，王笑丹，等. 舒筋健腰丸对骨关节炎大鼠关节软骨和血清中细胞因子的影响[J].2014，24（12）：862-865.

[10] 谢林，刘彦博，吴启富，等.舒筋健腰丸镇痛抗炎作用实验研究[C]//全国第十一届中西医结合风湿病学术会议，2013.

[11] Bennett GJ. What is spontaneous pain and who has it？[J]. J Pain，2012，13（10）：921-929.

[12] van Hecke O，Austin SK，Khan RA，et al. Neuropathic pain in the general population：a systematic review of epidemiological studies [J]. Pain，2014，155（4）：654-662.

[13] Hall GC，Morant SV，Carroll D，et al. An observational descriptive study of the epidemiology and treatment of neuropathic pain in a UK general population [J]. BMC Fam Pract，2013，14（1）：28.endprint

[14] Challa SR. Surgical animal models of neuropathic pain：pros and cons [J]. Int J Neurosci，2015，125（3）：170-174.

[15] Li Q，Tian Y，Wang ZF，et al. Involvement of the spinal NALP1 inflammasome in neuropathic pain and aspirin-triggered-15-epi-lipoxin A4 induced analgesia [J]. Neuroscience，2013，254：230-240.

[16] Sacerdote P，Franchi S，Moretti S，et al. Cytokine modulation is necessary for efficacious treatment of experimental neuropathic pain [J]. J Neuroimmune Pharmacol，2013，8（1）：202-211.

[17] Gong X，Chen Y，Fu B，et al. Infant nerve injury induces delayed microglial polarization to the M1 phenotype，and exercise reduces delayed neuropathic pain by modulating microglial activity [J]. Neuroscience，2017，349：76-86.

[18] Li K，Tan YH，Light AR，et al. Different peripheral tissue injury induces differential phenotypic changes of spinal activated microglia [J]. Clin Dev Immunol，2013，2013（10）：901420.

[19] Choi HS，Roh DH，Yoon SY，et al. Microglial interleukin-1β in the ipsilateral dorsal horn inhibits the development of mirror-image contralateral mechanical allodynia through astrocyte activation in a rat model of inflammatory pain [J]. Pain，2015，156（6）：1046-1059.

[20] Murakami T，Kanchiku T，Suzuki H，et al. Anti-interleukin-6 receptor antibody reduces neuropathic pain following spinal cord injury in mice [J]. Exp Ther Med，2013，6（5）：1194-1198.

（收稿日期：2017-04-28 本文編辑：李岳泽）endprint