,, ,

(1.重庆第二师范学院，重庆市功能性食品协同创新中心,重庆 400067;2.重庆第二师范学院,重庆市功能性食品工程技术研究中心,重庆 400067;3.重庆第二师范学院,功能性食品研发重庆市工程实验室,重庆 400067;4.重庆第二师范学院,生物与化学工程学院,重庆 400067;5.桂林医学院公共卫生学院食品卫生与营养学教研室,广西高校预防医学重点实验室,广西桂林 541004)

苦丁茶黄酮提取物对D-半乳糖致小鼠衰老的改善作用

赵欣1,2,3,4,易若琨1,2,3,4,孙鹏1,2,3,4,宋家乐1,2,3,5,*

(1.重庆第二师范学院，重庆市功能性食品协同创新中心,重庆 400067;2.重庆第二师范学院,重庆市功能性食品工程技术研究中心,重庆 400067;3.重庆第二师范学院,功能性食品研发重庆市工程实验室,重庆 400067;4.重庆第二师范学院,生物与化学工程学院,重庆 400067;5.桂林医学院公共卫生学院食品卫生与营养学教研室,广西高校预防医学重点实验室,广西桂林 541004)

针对苦丁茶黄酮提取物对D-半乳糖致小鼠衰老的改善作用进行了研究。以注射D-半乳糖(120 mg/kg)致衰老模型小鼠为实验对象,以其体质量、脏器指数、血清和组织指标为评价指标,使用试剂盒和RT-PCR法检测苦丁茶黄酮提取物(50和100 mg/kg)对衰老小鼠的血清和组织的影响,全面考察苦丁茶黄酮提取物的抗衰老作用。实验结果表明,苦丁茶黄酮提取物能显著(p<0.05)改善D-半乳糖造成的小鼠体质量下降及胸腺和脑器官指数下降。苦丁茶黄酮提取物可以提高D-半乳糖致衰老小鼠血清和肝组织中的总抗氧化能力(T-AOC)和降低丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)水平;同时苦丁茶黄酮提取物也提高了衰老小鼠血清和肝组织中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的酶活力。苦丁茶黄酮提取物还可以显著(p<0.05)上调衰老小鼠肝组织中神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(Gu/Zn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)的mRNA表达和下调诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达,且高浓度苦丁茶黄酮提取物(100 mg/kg)的效果优于同浓度的维生素C。

苦丁茶,黄酮,D-半乳糖,衰老,mRNA表达

衰老是一种生物体自发的必然过程,生物机体将逐渐表现机能衰退,适应性和抵抗力减退[1]。衰老与诸多疾病密切相关,包括高血压、2型糖尿病、动脉粥样硬化和老年痴呆等,可通过延缓衰老来减缓这些疾病的发生[2]。天然植物中包含黄酮在内的多种抗氧化成分,已经逐步被应用到抗氧化保健产品的开发中[3]。

苦丁茶是一种由冬青科冬青属的苦丁茶种常绿乔木树叶制成的特殊类茶饮品,在我国西南地区较为常见[4]。苦丁茶常作为保健饮品和药原料,传统中医学认为苦丁茶具有清热消暑、生津止渴和润喉止咳等功效[5]。最新的研究表明,苦丁茶及其含有的活性成分具有抗氧化、抗炎症和抗癌等作用[6-7]。不同溶剂的苦丁茶提取物均表现出一定的抗氧化效果,其中乙酸乙酯组分提取物的抗氧化效果最好,其中的主要成分是多酚和黄酮类物质[8],乙醇和ADS-17树脂能够进一步对植物黄酮进行提取及纯化[9]。同时有研究表明,苦丁茶黄酮具有较好的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力及三价铁还原能力,表现出良好的体外抗氧化能力[10]。近年来对黄酮类物质的抗氧化、抗衰老作用的研究表明,植物黄酮物质的绝大部分生理活性作用都是以其抗氧化效果为基础发挥的[11]。苦丁茶含有的黄酮化合物种类较多,含量也丰富,且不同地区产苦丁茶的黄酮种类和含量也存在差异[12]。但是由于苦丁茶的使用范围有限,针对其生物活性作用的深入研究不够,缺乏动物体内研究、临床研究和深入的分子层面的机制研究。本研究采用动物实验对苦丁茶中提取的黄酮类物质进行研究,对其抗衰老作用的分子机制进行较为深入的研究,将对进一步开发苦丁茶这种传统资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

实验动物 雄性6周龄SPF级KM(昆明)小鼠50只(体质量20～25 g)，购自于重庆医科大学动物实验中心,动物许可证号:SCXK(渝)2012-0001;苦丁茶 安国市祁珍养生食品有限公司出产野生苦丁茶;芦丁标准品 上海源叶生物科技有限公司;T-AOC、NO、SOD、GSH-Px、MDA试剂盒 南京建成生物工程研究所;CycleTESTTM PLUS DNA染色试剂盒 德国Becton Dickinson公司;Trizol试剂、oligodT18、RNase、dNTP和MLV 美国Invitrogen公司;RT-PCR引物nNOS、eNOS、iNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT 天根生化科技有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

Biomate3S型紫外可见光分光光度仪、A200PCR型仪、LUX型多功能性酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;Tancon2500PCR型凝胶成像仪 上海天能科技有限公司;ICEN-24R型高速冷冻离心机 杭州奥盛仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 苦丁茶黄酮物质的提取 称取1 kg冷冻干燥后的苦丁茶样品打粉,然后将苦丁茶粉末平均分为10份,每份中加入1 L浓度为70%(V/V)的乙醇溶液,在70 ℃水浴下浸提4 h后过滤,收集10份滤液并将滤液过硅藻土以除去脂溶性杂质,再次收集所有提取液;然后将提取液加入并通过装ADS-17树脂的层析柱,使苦丁茶黄酮类物质被树脂吸附。再用90%(V/V)的乙醇洗脱树脂,使树脂上吸附的黄酮物质溶于乙醇,最后采用旋蒸法蒸干乙醇得到苦丁茶黄酮粗提取物[9]。

1.2.2 苦丁茶黄酮物质含量的测定 称取一定量的芦丁标准品加入25 mL容量瓶中，加入10 mL的90%(V/V)的乙醇，依次再加入0.75 mL的5% NaNO2溶液、0.75 mL的10% Al(NO3)3溶液，10 mL的4% NaOH溶液，最后以90%的乙醇定容至刻度，配制成浓度分别为10、20、30、40和50 μg/mL的芦丁标准液，在500 nm处测定不同浓度芦丁标准液的吸光度，计算芦丁的标准曲线。取0.01 g苦丁茶黄酮提取物溶于5 mL 90%的乙醇，再取2 mL苦丁茶黄酮提取物溶液于25 mL容量瓶中，重复芦丁标准曲线测定方法测定苦丁茶黄酮提取物中黄酮的含量(芦丁计)。

1.2.3 动物实验 将适应环境喂养1周后的KM(昆明)小鼠随机分为正常组、衰老对照组、维生素C灌胃组(阳性对照组)、苦丁茶黄酮低浓度灌胃组和苦丁茶黄酮高浓度灌胃组,每组10只。实验开始后,正常组和衰老对照组小鼠每日灌胃0.2 mL蒸馏水;维生素C灌胃组、苦丁茶黄酮低浓度灌胃组和苦丁茶黄酮高浓度灌胃组小鼠每日分别灌胃维生素C(100 mg/kg)和苦丁茶黄酮(50和100 mg/kg)。2周后正常组小鼠每日继续灌胃0.2 mL蒸馏水;衰老对照组小鼠每日除继续灌胃0.2 mL蒸馏水外每日腹腔注射一次D-半乳糖(120 mg/kg);维生素C灌胃组和苦丁茶黄酮灌胃组小鼠除继续分别灌胃维生素C和苦丁茶黄酮提取物外也每日腹腔注射一次D-半乳糖(120 mg/kg),持续6周,每周测量小鼠体质量，然后对所有小鼠禁食24 h后断颈处死小鼠[12],心脏取血及取肝脏进行后续实验,同时测定胸腺和脑组织质量，计算指数：胸腺和脑组织器官指数(g/kg)=脏器质量(g)/小鼠体质量(kg)。

表1 本研究中RT-PCR实验的引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR experiment in this study

1.2.4 血清和肝脏组织T-AOC、NO和MDA水平测定 将小鼠的血浆静置1 h后离心分离(4 ℃,4000 r/min,15 min)后取上层血清,按试剂盒说明书测定小鼠血清中T-AOC、SOD和GSH-Px的活性。将小鼠肝脏制成10%的匀浆后离心分离(4 ℃,4000 r/min,15 min),取上清液按试剂盒说明书测定肝组织中T-AOC、NO和MDA的水平。

1.2.5 血清和肝脏组织SOD和GSH-Px活性测定 使用1.2.4的方法制备小鼠血清和肝脏匀浆,然后按试剂盒说明书测定血清和肝组织中SOD和GSH-Px的活性。

1.2.6 RT-PCR法测定肝组织的mRNA表达 取小鼠的肝组织匀浆用RNAzol提取肝组织的总RNA,然后将各组小鼠肝组织的总RNA浓度稀释到1 μg/μL。取2 μL稀释后的总RNA 提取液,在其中依次加入1 μL的OligodT18、RNase、dNTP、MLV酶和10 μL的5×Buffer,在37 ℃ 120 min,99 ℃ 4 min,4 ℃ 3 min条件下合成cDNA。然后以反转录-聚合酶链反应法扩增nNOS、eNOS、iNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达(表1),同时以持家基因(GAPDH)作为内参照按同样条件进行扩增。最后用含溴化乙锭琼脂(1%浓度)电泳检查PCR扩增产物,并用Image1.44软件进行半定量分析[13]。

1.3数据统计

对每只小鼠的血清和组织测定实验进行三次平行实验后取平均值,然后使用SAS 9.1统计软件采用one-way ANOVA方法分析各组数据在p<0.05 水平上相互是否具有显著差异。

2 结果与分析

2.1苦丁茶黄酮提取物的纯度

通过不同浓度芦丁标准液的OD值,绘制标准曲线为Y=0.0012X-0.001(R2=0.9936),然后计算得出苦丁茶提取物中黄酮物质的纯度为43.4%,有较多研究表明,黄酮提取液经过大孔树脂吸附后获得的物质中主要成分为黄酮类物质[14-16],因此,本研究中粗提取物的主要成分是苦丁茶的黄酮类物质。

2.2苦丁茶黄酮提取物对小鼠体质量变化的影响

本研究发现,小鼠在注射D-半乳糖后逐渐出现体质量增加缓慢,毛发失去光泽并开始脱落等情况,这与季文静等[17]的研究结果相一致。如图1所示,与正常组相比,衰老对照组小鼠体质量显著下降(p<0.05),表明腹腔注射D-半乳糖可使小鼠体质量下降;与衰老对照组小鼠相比,苦丁茶黄酮提取物处理组和维生素C处理组小鼠体质量显著(p<0.05)升高,表明苦丁茶黄酮和微生物可以缓解D-半乳糖造成的小鼠体质量下降。

图1 实验期间各组小鼠体质量变化(n=10)Fig.1 Changes of body weight of mice in each group during the experiment(n=10)

2.3苦丁茶黄酮提取物对小鼠器官指数的影响

当机体出现衰老时,胸腺和脑部将出现较其他器官更为明显的萎缩,胸腺衰老是免疫衰老的主导因素,大脑衰老则是机体衰老的特征性变化[17]。由表2可知,与正常组相比,衰老对照组小鼠胸腺指数和脑指数显著下降(p<0.05),表明腹腔注射D-半乳糖造成胸腺和脑组织萎缩;与衰老对照组小鼠相比,苦丁茶黄酮提取物处理组和维生素C和处理组小鼠的胸腺指数和脑指数都显著升高(p<0.05),表明这两组小鼠的胸腺和脑组织萎缩程度低于衰老对照组。可见,苦丁茶黄酮可以有效的抑制衰老造成的器官指数下降,缓解由D-半乳糖造成的胸腺和脑组织萎缩。

表2 各组小鼠器官指数(n=10)Table 2 Organ indexes of mice in each group(n=10)

注:同列不同小写字母表示差异显著(p<0.05),表3～表8同。2.4苦丁茶黄酮提取物对小鼠血清和肝组织中T-AOC、NO、MDA水平的影响

T-AOC是评价总抗氧化能力的重要指标,氧化自由基是导致人体衰老的最主要原因之一,通过提高机体T-AOC水平可起到减缓衰老的作用[18]。一氧化氮在机体内具有十分重要的作用,NO可以维持体内氧化平衡,当机体发生氧化损伤时,NO将大量产生,使机体失衡[13,19]。MDA同样是评价机体受氧化损伤的重要物质,高水平的MDA将导致机体脂质过氧化[13,20]。由表3和表4可知,与对照组小鼠相比,衰老对照组小鼠血清和肝脏组织中总抗氧化能力(T-AOC)显著降低(p<0.05),而NO和MDA含量显著升高(p<0.05),表明腹腔注射D-半乳糖造成了小鼠机体氧化损伤。与衰老对照组小鼠相比,苦丁茶黄酮提取物处理组小鼠血清和肝脏组织中总抗氧化能力(T-AOC)显著升高(p<0.05),而NO和MDA含量显著降低(p<0.05),表明灌喂50和100 mg/kg苦丁茶黄酮提取物能够显著改善D-半乳糖造成的氧化损伤。

表3 小鼠血清中T-AOC、NO和MDA水平(n=10)Table 3 The levels of T-AOC,NO and MDA in serum of mice(n=10)

表4 小鼠肝脏中T-AOC、NO和MDA水平(n=10)Table 4 The levels of T-AOC,NO and MDA in liver of mice(n=10)

2.5苦丁茶黄酮提取物对小鼠血清和肝组织中SOD和GSH-Px酶活的影响

SOD和GSH-Px是机体重要的抗氧化酶,提高机体中的SOD和GSH-Px酶活力可以有效的抑制氧化防止衰老[21-22]。由表5和表6可知,与对照组小鼠相比,衰老对照组小鼠血清和肝脏组织中SOD和GSH-Px活力显著降低(p<0.05),表明腹腔注射D-半乳糖能够降低小鼠机体抗氧化能力。与衰老对照组小鼠相比,苦丁茶黄酮提取物处理组小鼠血清和肝脏组织中SOD及GSH-Px活力显著升高(p<0.05),表明灌喂50和100 mg/kg苦丁茶黄酮提取物能够显著改善D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化能力。

表5 小鼠血清中SOD和GSH-Px酶活力(n=10)Table 5 The enzyme activities of SOD and GSH-Px in serum of mice(n=10)

表6 小鼠肝脏中SOD和GSH-Px酶活力(n=10)Table 6 The enzyme activities of SOD and GSH-Px in liver of mice(n=10)

2.6苦丁茶黄酮提取物对小鼠肝脏中nNOS、eNOS和iNOS mRNA表达的影响

表7 各组小鼠肝组织中nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表达强度的半定量分析(n=10)Table 7 Semi-quantitative analysis of mRNA expression of nNOS, eNOS and iNOS in liver tissue of mice in each group mice(n=10)

表8 各组小鼠肝组织中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达强度的半定量分析(n=10)Table 8 Semi-quantitative analysis of mRNA expressions levels of Mn-SOD, Gu/Zn-SOD,and CAT in liver tissue of mice in each group mice(n=10)

由图2和表7可知,与对照组小鼠相比,衰老对照组肝脏组织中神经型一氧化氮合酶(nNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA表达水平显著降低(p<0.05),而诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达水平显著升高(p<0.05),表明腹腔注射D-半乳糖能够对小鼠肝组织中的一氧化氮合酶产生影响。与衰老对照组小鼠相比,苦丁茶黄酮提取物处理组小鼠肝脏组织中nNOS和eNOS的mRNA表达水平显著升高(p<0.05),iNOS mRNA表达水平显著降低(p<0.05),表明灌喂50和100 mg/kg苦丁茶黄酮提取物能使肝组织中的 nNOS、eNOS和iNOS表达接近正常组小鼠。iNOS在被诱导后的短时间内可释放大量的NO,高浓度NO与氧自由基产生过氧亚硝酸根,诱导氧化应激,导致机体进一步氧化衰老;iNOS是与阿尔茨海默病发病相关应激酶之一,能通过释放高浓度NO导致氧化损伤[23]。研究表明nNOS基因敲除小鼠显示出由于加速衰老造成的记忆功能损伤[23-24],nNOS和eNOS均是基础表达的组织构成酶,参与学习记忆障碍的整个进程,通过延缓衰老改善学习记忆功能损伤后机体eNOS蛋白和表达均出现上升[23,25],而nNOS和eNOS在机体出现氧化受损后含量下降,提高机体内的nNOS和eNOS 含量也将有效控制衰老[13,26]。本研究中苦丁茶黄酮也可以有效的控制小鼠肝组织中iNOS表达含量,提高nNOS、eNOS表达含量以达到减缓衰老的目的。

图2 各组小鼠肝组织中nNOS、eNOS和iNOS的mRNA表达强度(n=10)Fig.2 mRNA expressions levels of nNOS,eNOS, and iNOS in liver tissue of mice in each group(n=10)

2.7苦丁茶黄酮提取物对小鼠肝脏中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达的影响

SOD存在三种异构体,Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和EC-SOD,机体内的Mn-SOD和Gu/Zn-SOD能控制自由基保持在低水平,保持机体健康。CAT具有清除氧自由基和促进过氧化氢分解的功效,能避免氧化对体内细胞的损伤[13,27]。由图3和表8可以看出,与对照组小鼠相比,衰老对照组肝脏组织中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达水平显著降低(p<0.05),表明腹腔注射D-半乳糖能够导致小鼠衰老。与衰老对照组小鼠相比,苦丁茶黄酮提取物处理组小鼠肝脏组织中Mu-SOD、GU/Zn-SOD和CAT的mRNA表达水平显著升高(p<0.05)。实验结果显示苦丁茶黄酮可通过提高机体内Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的含量抑制D-半乳糖对小鼠造成的氧化衰老。

图3 各组小鼠肝组织中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT的mRNA表达强度(n=10)Fig.3 mRNA expressions levels of Mn-SOD,Gu/Zn-SOD,and CAT in liver tissue of mice in each group(n=10)

3 结论

本研究通过D-半乳糖建立小鼠衰老模型来检测苦丁茶黄酮的衰老预防作用。实验结果显示，苦丁茶黄酮可以有效的抑制衰老造成的小鼠体质量下降,同时可以抑制衰老造成的胸腺和脑器官指数下降。通过对小鼠血清和肝组织的检测进一步发现苦丁茶黄酮能够提高D-半乳糖导致衰老小鼠的T-AOC水平和降低MDA、NO水平,同时也能提高SOD和GSH-Px酶活力。通过RT-PCR实验证明,苦丁茶黄酮可上调衰老小鼠肝组织中nNOS、eNOS、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT的mRNA表达和下调iNOS表达。以上的实验结果充分证实了苦丁茶黄酮具有很好的衰老预防作用,且效果优于同浓度的维生素C。通过本研究的结果将为进一步对苦丁茶黄酮的纯化和抗衰老作用的临床研究提供支持。

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ImprovementeffectsofKudingteaflavonoidsextractsonD-galactoseinducedmiceaging

ZHAOXin1,2,3,4,YIRuo-kun1,2,3,4,SUNPeng1,2,3,4,SONGJia-le1,2,3,5,*

(1.Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;2.Chongqing Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 3.Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food, Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 4.College of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 5.Department of Food Hygiene and Nutrition,School of Public Health,Guilin Medical University,Guilin 541004,China)

The improvement effects of Kuding tea flavonoids extracts(KFE)on D-galactose induced aging in mice were studied in this study. Aging moded mice induced by the D-galactose injection(120 mg/kg)were experimental subjects whose body weight,organ index,serum and tissue index were evaluating indicators. Experiment kit and RT-PCR detection methods were used for determination the effects of KFE(50 and 100 mg/kg)on serum and tissue of aging mice,the anti-aging effects of KFE were comprehensive investigated. The experiment results showed that KFE could significantly(p<0.05)improve the weight loss,thymus and brain organ index decreasing of mice by D-galactose treatment. KFE could raise total antioxidative capability(T-AOC)level and reduce malondialdehyde(MDA)and nitric oxide(NO)levels,meanwhile KFE also increased enzyme activity of superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GSH-Px)in serum and hepatic tissue of aging mice. KFE also increased significantly(p<0.05)raise neuronal nitric oxide synthase(nNOS),endothelial nitric oxide synthase(eNOS),manganese superoxide dismutase(Mn-SOD),copper zinc superoxide dismutase(Gu/Zn-SOD),catalase(CAT)mRNA expressions and reduce inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression,and high concentration of KFE(100 mg/kg)showed the better effects than the same concentration of vitamin C.

Kuding tea;flavonoid;D-galactose;aging;mRNA expression levels

2017-02-07

赵欣(1981-)，男，博士，教授，研究方向：食品营养和功能性食品，E-mail:zhaoxin@cque.edu.cn。

*通讯作者:宋家乐(1983-)，男，博士，副教授，研究方向：食品营养和功能性食品，E-mail:songjiale@glmc.edu.cn。

重庆高校创新团队建设计划资助项目(CXTD201601040)；重庆第二师范学院引进高层次人才项目(2013BSRC001)；重庆市工程技术研究中心建设项目(cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)16-0303-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.057