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(1.普洱茶研究院,云南普洱 665000;2.滇西应用技术大学普洱茶学院,云南普洱 665000)

HS-SPME结合GC-MS分析普洱茶花及茶花粉香气成分

张文杰1,刘聪1,严亮1,2,郑婷婷1,马莉1,赵苗苗1

(1.普洱茶研究院,云南普洱 665000;2.滇西应用技术大学普洱茶学院,云南普洱 665000)

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对普洱茶花和茶花粉中挥发性香气成分进行分析。首先对HS-SPME参数进行优化,确定了HS-SPME最优参数为:65 μm PDMS/DVB萃取头,萃取温度70 ℃,萃取时间60 min。从普洱茶花和茶花粉中分别检测出65和51种香气成分,各占其总香气成分的87.72%和82.77%,主要为醇类、烷烃类、醛类、烯烃类、酮类、酯类、酚类、酸类、含氮类和萘类化合物。其中,芳樟醇、α-甜没药烯、姜黄烯、十二烷和6,10,14-三甲基-2-十五烷酮为普洱茶花主要香气成分;芳樟醇、香叶醇、萜品醇、壬醛和甲氧基丁香酚为茶花粉主要香气成分。该研究结果为普洱茶花及深加工产品香气品质的评价提供了检测技术和理论依据。

普洱茶花,茶花粉,HS-SPME,GC-MS,挥发性香气成分

茶花(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze[TheasinensisL.])为山茶科、山茶属、茶组植物茶树的花,是茶树的繁殖器官之一,主要是依靠昆虫传播花粉[1]。茶花素有“安全植物的胎盘”、“茶树上的精华”的美誉[2-3]。茶花与茶叶一样,对人健康有益,其化学成分也与茶叶大体相同[4],含有丰富的茶多酚、茶多糖、蛋白质、黄酮类、茶皂素、氨基酸、维生素、微量元素等多种有益成分和活性物质[5-6]。 其中茶多酚8.2%～13.02%,氨基酸0.8%～3.2%,咖啡碱1%～2.59%,蛋白质27.46%,水溶性多糖28.8%～41.4%,黄酮类3.6%～8.9%[7-8]。蛋白质和茶多糖含量明显高于茶叶[6]。

云南省茶园面积超过570万亩,居全国第二,茶花产量巨大[9],但对其研究和开发都还处于起步阶段。研究表明茶花具有防癌抗癌、抗氧化、增强免疫力、降糖、降血压等功效[10-15],其中茶花的抗氧化能力与公认的抗氧化植物迷迭香的抗氧化能力不相上下[14]。茶花不但具有多种功效,同时具有独特的香气,凌彩金等[16]分别对云南大叶、台茶、八仙茶和清远笔架茶花感官分析,表明云南大叶、清远笔架茶花具有浓郁的清香,台茶和八仙茶具有清香带甜的香气。甘秀海等[17]采用HS-SPME/GC-MS对山茶花、油茶花和茶树花3种茶花香气成分进行分析,发现3种茶花均具有自己独特的香气成分,山茶花的特有香气成分为丁香酚、醋酸癸酯等;油茶花特有香气成分为3-甲基-二氢-2(3H)呋喃酮、月桂烯等;茶树花主要香气成分为6,10,14-三甲基-2-十五烷酮、柠檬醛等。吴颖瑞等[18]采用HS-SPME-GC/MS对六堡茶茶花香气成分进行分析,发现六堡茶茶花香气成分主要为苯乙酮、紫苏烯、顺式-3-蒈烯、顺式-α-榄香烯、苯甲酸乙酯、塞瑟尔烯、α-蒎烯、新丁香三环烯、衣兰烯、顺式芳樟醇氧化物等。王晨等[9]对普洱茶花进行香气成分分析,结果仅检测出9种成分,主要为萘、脱氢芳樟醇、β-紫罗酮等。从以上研究报道中可知,不同茶花香气成分组成均存在一定的差异,对普洱茶花香气的深入研究,可为其利用提供理论基础。

固相微萃取(SPME)技术是一种新型的无溶剂样品预处理技术,这种技术集取样、萃取、浓缩和进样为一体,具有操作简单、样品用量少、无需使用溶剂、萃取样品后可直接色谱进样等优点[20],现已广泛应用于各种茶叶香气的分析,如普洱茶[19]、红茶[20]、绿茶[21]等。本研究首先对不同的萃取头进行考察,根据各萃取头富集普洱茶花香气成分中各物质的量,确定最佳的萃取头,同时对萃取温度和时间进行考察,在条件考察的基础上对茶花、茶花粉样品进行分析,为茶花及其深加工产品的开发提供科学依据及理论参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

普洱茶花(外形:花型完整、黄稍暗;香气:呈清香、甜花香;2016年) 购置于普洱市茶叶市场,粉碎后过2.0 mm圆孔筛,冰箱保存备用;茶花粉(外形:粉末状、黄褐色;香气:呈甜花香;2016年)是茶树花经水提取、浓缩、真空冷冻干燥加工而成;氯化钾(分析纯) 天津市化学试剂一厂,使用前120 ℃烘2 h。

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美国Agilent公司;固相萃取头(100 μm PDMS、85 μm PA、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS)、固相微萃取装置、手动进样手柄 美国Supelco公司;IT-09A型恒温磁力搅拌 上海一恒科学仪器有限公司;YP1200型电子天平 上海精科电子有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 HS-SPME条件考察

1.2.1.1 萃取头筛选 取6.0 g已粉碎的样品放置于100 mL顶空瓶中,放入转子,加入6.0 g KCl,冲入煮沸的蒸馏水30 mL,立即密封顶空瓶。将样品瓶置于加热的磁力搅拌器上,萃取温度60 ℃、400 r/min条件下平衡10 min,插入萃取头。其中,萃取头使用之前,按说明书条件进行老化:PDMS 250 ℃老化0.5 h;PA 300 ℃老化2 h;CAR/PDMS 300 ℃老化1 h;PDMS/DVB 250 ℃老化0.5 h;DVB/CAR/PDMS 270 ℃老化1 h,吸附60 min,然后将手动SPME装置插入气相色谱(GC)进样口,250 ℃解吸附3.5 min,同时启动仪器收集数据。分别考察65 μm DVB/PDMS、75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、100 μm PDMS、85 μm PA 5种萃取头对普洱茶茶花香气的萃取效果。

1.2.1.2 萃取温度考察 采用65 μm DVB/PDMS萃取头,固定其它因素(其它因素与1.2.1.1描述相同),考察不同萃取温度(40、50、60、70、80 ℃)对茶花香气的吸附效率。

1.2.1.3 萃取时间考察 采用65 μm DVB/PDMS萃取头,萃取温度70 ℃,固定其它因素(其它因素与1.2.1.1描述相同),考察不同萃取时间(30、40、50、60、70 min)对茶花香气的吸附效率。

1.2.2 仪器条件 GC条件:进样方式:手动进样;色谱柱:HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:初始温度50 ℃,保持5 min,然后以3 ℃/min升温至200 ℃,再以10 ℃/min升温至250 ℃,总运行时间为60 min;载气:高纯氦气,纯度≥99.999%;载气流速1.0 mL/min;进样口温度250 ℃;进样模式:无分流进样。

MS条件:离子源为EI源,电子能量70 eV;接口温度为280 ℃;离子源温度为230 ℃;四极杆温度为150 ℃;发射电流为34.6 A;扫描方式:全扫描;质量扫描范围:35～450 aum;溶剂延迟时间:3.0 min。

1.3数据处理

采用质谱自带的NIST 08和Wiley 7谱库检索定性分析,以MS相似度接近度最高的化学结构为最佳鉴定结果。同时采用峰面积归一化法定量,以各组分峰面积与色谱图总峰面积之比值表示其相对含量。

2 结果与分析

2.1萃取头选择

图1 5种萃取头对普洱茶花香气成分萃取量的比较Fig.1 Comparison of the content of aroma components extracted by five fibers

实验对五种萃取头进行考察,结果见图1。由图1可知,PDMS/DVB萃取效率最高,其次为CAR/PDMS、DVB/CAR/PDMS,PA萃取效率最低。因为PDMS/DVB萃取头是由65 μm聚二甲基硅氧烷和二乙烯基苯复合材料制成,该萃取头更适合富集极性挥发性物质;CAR/PDMS由75 μm碳分子筛和聚二甲基硅氧烷复合材料制成,该萃取头微孔比例较高,更适合富集痕量有机物;PDMS为聚二甲基硅氧烷,该萃取头更适合富集小分子非极性物质;PA为聚丙烯酰胺制成,该萃取头更适合富集极性半挥发性物质[22]。从分析结果看,茶花中主要为极性挥发性物质,因此PDMS/DVB表现出了最高的萃取效率。

2.2萃取温度选择

萃取温度考察结果见图2。由图2可知，随着萃取温度的升高,总峰面积随之增大,在70 ℃时达到最大值,因为温度升高,分析物扩散速度增大,同时加强了对流过程,有利于提高分析速度。当温度大于70 ℃,总峰面积随之减小,因为温度进一步升高,使分析物的分配系数减小,从而使固相吸附量减小。综合以上结果,适宜的吸附温度为70 ℃。

图2 萃取温度对总峰面积的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on total peak area

2.3萃取时间选择

萃取时间考察结果见图3。由图3可知，随着吸附时间的延长,香气的吸附量逐渐增加,在60 min时吸附量达到最大,随着时间的再次延长,吸附量趋于平衡。因为萃取时间与分析物的分配系数、扩散速度、样品基质、样品体积、萃取头膜厚度及吸附能力等因素决定,在为达到吸附平衡之前,吸附量随着时间的延长而增大,吸附平衡后,吸附量不再随时间的延长而改变。

图3 萃取时间对总峰面积的影响Fig.3 Effects of extraction time on total peak area

2.4方法重复性

取普洱茶花(粉碎样品)5份,每份6.0 g,按优化方法进行处理,然后进行GC-MS分析,5次重复实验总峰面积的RSD均小于6.8%,色谱峰保留时间的RSD均小于2.6%,表明该方法用于分析普洱茶花香气重复性良好,符合分析要求。

2.5普洱茶花和茶花粉挥发性香气成分分析

在HS-SPME萃取条件优化的基础上,分别对普洱茶花和茶花粉挥发性香气成分进行分析,GC-MS分析得到总离子流图如图4、图5所示,普洱茶花和茶花粉香气成分及其相对含量结果见表1所示。从普洱茶花和茶花粉中共鉴定出65种化合物,主要包括醇类、烷烃类、醛类、烯烃类、酮类、酯类、酚类、酸类、含氮类和萘类化合物。

图4 普洱茶花挥发性成分GC-MS总离子流色谱图Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in pu-erh tea flower

图5 普洱茶花粉挥发性成分GC-MS总离子流色谱图Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in pu-erh tea flower powder

表1 普洱茶花和茶花粉挥发性成分的GC-MS分析结果Table 1 GC-MS analysis result of volatile components in pu-erh tea flower and flower powder

续表

注:“-”表示未检出。

在普洱茶花中共鉴定出65种香气成分,占总香气成分的87.72%。其中含量相对较高的化合物为芳樟醇(14.59%),α-甜没药烯(4.68%),姜黄烯(4.64%),十二烷(4.52%),6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(4.30%),苯甲酸苄酯(3.87%),香叶基丙酮(3.59%),α-紫罗兰酮(3.19%),反式-α-紫罗兰酮(3.03%),(E)-橙花叔醇(2.96%),氧化芳樟醇 Ⅱ(2.53%),萜品醇(2.39%),氧化芳樟醇 Ⅲ(2.02%),2,6,10,14-四甲基十五烷(2.02%),(R)-(+)-1-苯基乙醇(1.91%),壬醛(1.75%),香叶醇(1.68%),氧化芳樟醇 Ⅰ(1.65%),D-大根香叶烯(1.54%)等。

在茶花粉中共鉴定出51种香气成分,占总香气成分的82.77%。其中含量相对较高的化合物为芳樟醇(26.83%),香叶醇(7.80%),萜品醇(7.36%),壬醛(6.96%),甲氧基丁香酚(4.17%),邻苯二甲酸二异丁酯(2.89%),α-甜没药烯(2.69%),6,10,14-三甲基-2-十五烷酮(2.69%),棕榈酸(2.05%),香叶基丙酮(1.66%),2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(1.62%)等。

普洱茶花和茶花粉中芳樟醇含量均最高,芳樟醇具有花香、木香,其香气新鲜纯正持久[23];α-甜没药烯具有草香和辛香;香叶醇具有温和、甜玫瑰花香气,黄致喜认为香叶醇是一种良好的定向溶剂[24];萜品醇具有丁香气味[19];香叶基丙酮具有新鲜、清、淡的花香香气,是普洱生茶的主要香气成分之一[9];壬醛具有玫瑰、柑橘等香气,同时具有强烈的油脂气味[19]。同时在普洱茶花中α-紫罗兰酮(具有紫罗兰香气),(E)-橙花叔醇(玫瑰、铃兰和苹果花的气息,香气持久),氧化芳樟醇(花香、木香)等物质含量也较高。这些物质是普洱茶花香气的主要贡献者,其贡献度还需要结合GC-O、香气提取稀释法(AEDA)和定量分析进一步确定。

2.6普洱茶花和茶花粉挥发性香气成分比较

普洱茶花和茶花粉含量较高的香气种类主要是醇类、烷烃类、醛类、烯烃类、酮类和酯类,其中烷烃类一般不具有气味,对整体香气贡献度不大[19]。从表2中可以看出,醇类化合物为普洱茶花和茶花粉主要挥发性成分,相对含量均较高,且普洱茶花制作成茶花粉后其相对含量明显提高;烷烃类、醛类、烯烃类、酮类、酯类和含氮类化合物,普洱茶花制作为茶粉后化合物数量均减少,醛类化合物相对含量明显升高,酮类、酯类和含氮类化合物相对含量明显降低;酚类和酸类化合物,普洱茶花制作为茶粉后化合物数量均不变,但相对含量均明显升高。

表2 普洱茶花和茶花粉挥发性成分比较结果Table 2 The comparison results of pu-erh tea flower and flower powder

在普洱茶花制作为茶花粉的过程中由于浸提、浓缩、干燥等工艺,化合物丢失,导致化合物数量明显减少。由于采用低温冷冻干燥工艺,对主要香气成分,如芳樟醇、香叶醇、萜品醇等具有很好的保留。

3 结论

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对普洱茶花和茶花粉中挥发性香气成分进行分析。优化确定了HS-SPME最佳参数为65 μm PDMS/DVB萃取头,萃取温度70 ℃,萃取时间60 min。从普洱茶花和茶花粉中分别检测出65和51种香气成分,各占其总香气成分的87.72%和82.77%,主要为醇类、烷烃类、醛类、烯烃类、酮类、酯类、酚类、酸类、含氮类和萘类化合物。该研究结果为普洱茶花及深加工产品香气品质的评价提供了检测技术和理论依据。

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Analysisofaromacomponentsinpu-erhteaflowerandflowerpowderbyheadspacesolid-phasemicroextractioncoupledwithGC-MS

ZHANGWen-jie1,LIUCong1,YANLiang1,2,ZHENGTing-ting1,MALi1,ZHAOMiao-miao1

(1.Pu’er Institute of Pu-erh Tea,Pu’er 665000,China;2.College of Tea(Pu’ er),West Yunnan University of Applied Sciences,Pu’ er 665000,China)

The aroma compounds of pu-erh tea flower and flower powder were analyzed by head-phase micro-extraction(HS-SPME)coupled with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). The parameters of HS-SPME were initially evaluated. The optimal extraction parameters were achieved under the following conditions:65 μm PDMS/DVB fiber,extraction temperature 70 ℃,extraction time 60 minutes. Under the optimal conditions,65 and 51 kinds of compounds were identified in pu-erh tea flower and tea flower powder,accounting for 87.72% and 82.77%,respectively. The major constituents were alcohols,alkanes,aldehydes,alkenes,ketones,esters,phenols,acids,nitrogens,and naphthalenes compounds. Linalool,α-bisabolene,curcumene,eicosane,and 6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone were the characteristic compounds in pu-erh tea flower. Linalool,geraniol,terpineol,nonanal,and methoxyeugenol were the characteristic compounds in tea flower powder. These results could provide a theoretical basis for the evaluation of aroma quality of pu-erh tea flower and its deep processing products.

pu-erh tea flower;pu-erh tea flower powder;HS-SPME;GC-MS;aroma compounds

2017-02-07

张文杰(1985-)，男，硕士，研究方向：茶叶等生物资源开发利用及其生物技术，E-mail：zhangwenjie879@163.com。

TS272

:A

:1002-0306(2017)16-0257-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.049