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(1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京工商大学,北京 100048;2.北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京工商大学,北京 100048;3.北京市经济管理学校,北京 100142)

高产靛蓝色素大肠杆菌工程菌的构建及靛蓝色素稳定性

杜灵燕1,2,张策3,车逸心1,刘雯娴1,王孟菲1,尹胜1,2,*,王成涛1,2,*

(1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京工商大学,北京 100048;2.北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京工商大学,北京 100048;3.北京市经济管理学校,北京 100142)

目前国内外天然食用蓝色素资源稀缺,利用微生物发酵制备的靛蓝色素是天然蓝色素的重要来源之一。本文克隆了假单胞菌B3的苯乙烯单加氧酶基因styAB,将其在大肠杆菌中进行了异源超量表达,构建了高产靛蓝色素的基因工程菌株E-AB,并研究了温度和光照等环境因素对靛蓝色素稳定性的影响。结果表明,工程菌以吲哚为底物合成靛蓝色素最高产量为68.9 mg/L,较野生型菌株提高约5.4倍。温度和光照条件对靛蓝色素色度稳定性具有显著性影响,低温和避光条件能显著延缓靛蓝色素的降解,而高温和紫外光则加速其降解;靛蓝色素降解反应较复杂,靛红是主要的降解产物之一。研究结果将为天然靛蓝色素的高效生物转化制备及应用提供了理论支持和技术指导。

靛蓝色素,基因工程菌株,苯乙烯单加氧酶,发酵,色素稳定性

靛蓝又名蓝靛、靛青,是一种广泛应用于食品、医药、印染和化妆品等行业的古老传统色素[1-2]。天然靛蓝色素主要从木蓝、菘蓝、蓼蓝、马蓝、野青树等植物中提取,颜色鲜艳而耐久,安全性高。随着蓝色素市场需求不断扩大,传统植物提取法受到资源、成本以及工艺技术限制,逐渐被化学合成法所替代。我国目前广泛使用的化学合成靛蓝色素主要是“亮蓝”和“亮蓝铝色淀”。化学合成法具有生产工艺简便、色素产量高且稳定等优势,但因使用苯胺、硝基苯等化工原料,产生有毒废料废水,危害环境和人体健康,不符合“环境友好型”、“生产者友好型”的发展要求。因此,新型“绿色制备技术”是靛蓝色素制造的重要发展方向[3]。上世纪90年代,研究者首次报道了微生物合成靛蓝色素现象[4-7]。后期研究发现,具有合成靛蓝能力的微生物大多数都是芳烃降解菌,通过单加氧酶或双加氧酶催化吲哚或其氧化物合成靛蓝色素。与化学合成色素相比,微生物发酵不受原料资源限制,且具有高效、高选择性、条件温和以及绿色安全等特点。野生型菌株催化合成靛蓝体系中因存在旁路反应、副反应,靛蓝产量一般较低。因此,利用基因工程技术构建催化靛蓝合成关键酶的超量表达菌株,是提高靛蓝生物合成量的有效途径[8-11]。

本课题组在前期研究中,筛选获取具有靛蓝合成能力的野生型菌株假单胞菌B3(PseudomonasputidaB3),明确了其是以吲哚为底物由styAB基因编码的苯乙烯单加氧酶(SMO)催化合成靛蓝色素。该靛蓝色素合成途径单一,无副产物生成,是靛蓝色素的高效转化途径[12]。为实现SMO异源超量表达和靛蓝色素高效合成,本研究拟通过基因工程技术,在大肠杆菌中超量表达styAB基因,构建靛蓝色素高效转化菌株[13-20]。

靛蓝色素是一种脂溶性偶氮类色素,能够溶解于少数几种有机溶剂,且稳定性较差,容易褪色[21-24]。目前关于环境因素对靛蓝稳定性的研究较少,靛蓝降解机制仍不明确。因此本研究将探究不同的光照和温度环境因素对天然靛蓝色素稳定性的影响,并通过分析靛蓝色素降解产物初探其降解机制,旨在为靛蓝色素工业化生产制备和应用提供理论支持和技术指导。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

PseudomonasputidaB3、大肠杆菌表达载体质粒pET-28a 由本实验室保存;EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)感受态细胞 北京天根生化科技有限公司;靛蓝、靛红、吲哚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇等 半夏生物科技有限公司;PrimeSTAR Max Premix(2×)DNA聚合酶、核酸限制性内切酶BamHI、HindIII和T4 DNA连接酶等 宝生物工程(大连)有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒和多功能DNA纯化回收试剂盒 北京天根生化科技有限公司;LB液体、固体培养基和发酵培养基 按文献配制[17]。

C1000 Touch PCR仪、PowerPac Basic电泳仪(水平电泳槽) 美国BIO-RAD公司;3K15高速离心机 美国SIGMA公司;SPX-150B生化培养箱 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;1290 Infinity高效液相色谱 美国Agilent Technologies公司;CM-3610色差仪 日本柯尼卡美能达公司。

1.2实验方法

1.2.1 苯乙烯单加氧酶基因styAB的克隆及表达载体pET28a-styAB的构建 提取野生型菌株PseudomonasputidaB3基因组作为模板,按照GenBank中苯乙烯单加氧酶基因序列(Accession no. DQ177365.1)设计引物:

F-AB-BamHI(CGGGATCCATGAAAAAGCGT ATCGGTATTG)

R-AB-HindIII(CCCAAGCTTTCAATTCAGTGG CAACGGGTT)。

利用PCR技术扩增styAB基因,电泳检测,纯化回收并测序分析。目的基因和质粒pET-28a经BamHI和HindIII双酶切并纯化回收,连接产物转化至E.coliDH5α感受态,在含有50.0 μg/mL卡那霉素LB固体培养基平板上筛选阳性重组子;挑取单菌落接种至LB液体培养基培养,提取质粒,酶切鉴定并测序分析,筛选获得构建正确的表达载体pET28a-styAB。

1.2.2styAB基因表达工程菌E-AB的构建及培养方式 将表达载体pET28a-styAB化学转化至宿主菌E.coliBL21(DE3),于含有50.0 μg/mL卡那霉素LB固体培养基平板上筛选获得阳性重组子E-AB。培养方式:挑取单菌落E-AB接种至含50.0 μg/mL卡那霉素LB液体培养基中,于37 ℃,200 r/min过夜培养;按1%接种量重新接种至新鲜LB液体培养基中,当OD600达0.4时,加入0.2 mmol/L IPTG诱导培养;至OD600为0.8,收集菌液(二级种子液)备用。

1.2.3 靛蓝色素发酵制备 分别制备P.putidaB3和E-AB二级种子液,按1.0%接种至50.0 mL含吲哚浓度为40.0、80.0、120.0、160.0、200.0和240.0 μg/mL的发酵培养基中,30 ℃,200 r/min培养24 h,测定发酵液中靛蓝产量。

1.2.4 靛蓝浓度的测定

1.2.4.1 酶标仪法测定发酵液中靛蓝产量 标准曲线的制作:将靛蓝标品用N,N-二甲基甲酰胺溶解定容成50.0 μg/mL的标准溶液,然后依次稀释成7.0、9.0、11.0、13.0和15.0 μg/mL的浓度梯度,用酶标仪测定610 nm波长处吸光值,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线:Y=0.0507X-0.0227，R2=0.999。

发酵培养基接入底物色氨酸反应一段时间后,9000 r/min离心20 min,沉淀物加入适量N,N-二甲基甲酰胺,超声处理20 min,待沉淀全部溶解后用酶标仪测定610 nm波长处吸光值,并根据标准曲线计算靛蓝浓度。

1.2.4.2 高效液相法测定靛蓝浓度 采用高效液相色谱发测定靛蓝浓度,色谱条件为:C18色谱柱;流动相:甲醇∶水(60∶40);柱温:30 ℃;流速:100 μL/min;紫外检测波长:298 nm;进样量:1 μL,出峰时间2.1 min[17]。

标准曲线制作:将靛蓝标品用DMF溶解定容成100 μg/mL的标准溶液,然后依次稀释成70.0、60.0、40.0、20.0、10.0 μg/mL的浓度梯度,用高效液相色谱测定298 nm波长处吸收峰面积,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线:Y=9.3582X+35.296，R2=0.993。

1.2.5 高效液相法测定靛红浓度 采用高效液相色谱测定靛红浓度,除出峰时间为1.2 min外,具体条件同1.2.4.2,标准曲线方程为Y=11.048X+23.685，R2=0.996。

1.2.6 靛蓝和靛红DMF溶液色差测定 取适量靛蓝和靛红标品DMF溶液分别注入石英石比色皿内,用色差仪测量溶液的L*值(亮度值)、a*值(绿值)、b*值(蓝值),并根据公式计算色差ΔE。

ΔE=(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)1/2

式中,ΔL*-样品与初始标准品亮度差;Δa*-样品与初始标准品绿值差;Δb*-样品与初始标准品蓝值差。

1.2.7 环境因素对靛蓝稳定性影响 以靛蓝、靛红含量和色差指标,研究不同温度和光照对靛蓝稳定性的影响。

1.2.7.1 光照对靛蓝稳定性影响 取100 mL 70.0 μg/mL靛蓝标品DMF溶液注入数个无菌小瓶中,室温静置,分别置于紫外线、自然光、避光条件下,每隔24 h取样测定(紫外条件下每隔1 h取样)溶液中靛蓝、靛红含量以及与靛蓝、靛红初始标准DMF溶液的色差,平行重复三次,取平均值进行计算。

1.2.7.2 温度对靛蓝稳定性影响 取100 mL 70.0 μg/mL靛蓝标品DMF溶液注入数个无菌小瓶中,室温静置,分别置于4 ℃、室温和37 ℃条件下,每隔24 h取样测定溶液中靛蓝和靛红含量、色度,平行重复三次,取平均值进行计算。

1.3数据处理

实验中每个处理平行重复3次,采用SPSS 17.0软件进行数据的处理和分析,采用Excel进行绘图。

2 结果与讨论

2.1苯乙烯单加氧酶基因styAB的克隆及重组表达载体pET28a-styAB的构建

以PseudomonasputidaB3全基因组为模板,PCR扩增styAB基因,经电泳检测,扩增条带约为1900 bp(图1);将纯化的PCR产物进行测序分析,其核苷酸序列与GenBank中报道[11]的假单胞菌苯乙烯单加氧酶基因相似度达100%。将经双酶切的styAB基因PCR产物插入表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-styAB。酶切鉴定电泳图(图2)表明,7400 bp的重组质粒经双酶切后呈现1900 bp和5500 bp两条条带,分别与styAB基因PCR产物和空载质粒pET28a大小一致,表明重组表达载体pET28a-styAB构建成功。

图1 styAB基因PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of the styAB gene PCR product注:M:DL2000 DNA Marker;1、2:styAB基因PCR扩增产物。

图2 重组质粒pET28a-styAB双酶切电泳图Fig.2 Double digestion of the recombinant plasmid pET28a-styAB注:M:DL10000 DNA Marker;1:重组质粒pET28a-styAB双酶切电泳条带。

2.2styAB基因表达工程菌E-AB的构建及靛蓝色素发酵

将质粒pET28a-styAB转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,在含卡那霉素的LB抗性平板上筛选阳性转化子,获得工程菌株E-AB。将工程菌株E-AB接种至发酵培养基中培养24 h,发酵培养液中呈现大量蓝色颗粒沉淀,而野生型菌株E.coliBL21(DE3)中并未出现蓝色颗粒沉淀,表明苯乙烯单加氧酶styAB基因在工程菌株E-AB中成功表达,具有催化吲哚合成靛蓝色素的能力。此外,通过与野生型靛蓝合成菌株PseudomonasputidaB3对比底物吲哚不同浓度下靛蓝色素产量,发现二者有明显差异(图3)。如图3所示,随着吲哚浓度的增加,两株菌靛蓝产量均呈现先增加后降低的趋势,出现此现象与吲哚对菌体的毒副作用相关。此外,明显发现PseudomonasputidaB3在吲哚浓度为80.0 μg/mL时,靛蓝产量最高为10.8 mg/L,而E-AB在浓度为160.0 μg/mL时,靛蓝产量最高为68.9 mg/L,较野生型菌株提高近5.4倍。可见E-AB能明显提高吲哚的利用量,显著提高靛蓝色素产量(p<0.05)。上述结果表明,styAB基因大肠杆菌异源表达,可实现苯乙烯单加氧酶的高效表达,进一步提高靛蓝色素产量。

图3 吲哚浓度对Pseudomonas putida B3和E-AB产靛蓝色素的影响Fig.3 The effect of indole concentration on indigo production from Pseudomonas putida B3 and E-AB

2.3环境因素对靛蓝色素稳定性的影响

2.3.1 不同光照条件下靛蓝色素溶液颜色和物质含量的变化 前期研究发现,靛蓝色素DMF溶液颜色随时间不断变化,由最初的蓝色最终变化为橘红色,该颜色与靛红DMF溶液颜色接近[21-23]。为了揭示靛蓝色素DMF溶液的变化规律,研究了不同光照条件下靛蓝色素DMF溶液颜色随时间变化与初始靛蓝和靛红标准液颜色差异情况。结果如图4所示。随着时间增加,靛蓝色素DMF溶液颜色与初始靛蓝DMF标准液总色差不断增加,即呈现与靛蓝DMF标准液颜色差异增加的趋势;而与初始靛红DMF标准液总色差不断减小,即颜色上不断接近的趋势。上述结果从色差水平说明靛蓝色素DMF溶液在变化过程中可能有靛红的生成,但因其与初始靛红DMF标准液仍存在色差,说明可能有某种中间产物的存在。此外,不同光照条件下,呈现类似变化规律,但颜色变化速率明显不同,光照对靛蓝色素稳定性影响极显著(p<0.01)。自然光条件下,颜色缓慢变化,紫外线照射能显著增加变化速率,避光处理能显著延缓颜色变化。

图4 不同光照条件下靛蓝色素DMF溶液色度的变化 Fig.4 The colourity change of the indigo DMF solution under different light conditions注:A:避光和自然光条件下靛蓝色素DMF溶液色度的变化; B:紫外光条件下靛蓝色素DMF溶液色度的变化。

为了进一步探究不同光照条件下靛蓝色素DMF溶液色度变化的原因,利用高效液相色谱方法对靛蓝色素DMF溶液中的靛蓝和靛红含量变化进行了检测。结果如图5所示。自然光条件下,靛蓝色素含量缓慢降低,72 h后靛蓝降解量达到初始含量的50%以上,同时靛红含量增加至靛蓝初始量的65%。紫外光照射下,靛蓝降解速率明显加快,6 h后靛蓝含量几乎为0,而靛红含量为靛蓝初始量的16%;随着时间增加,靛红含量不断增多,72 h靛红含量增加至靛蓝初始量的65%左右。避光条件下,72 h靛蓝含量几乎不变化且靛红基本不生成。上述结果表明靛蓝降解与靛红生成具有正相关性,但二者变化速率存在差异。根据靛红和靛蓝结构式可知,理论上一份子靛蓝可降解为两分子靛红,而上述变化量明显不符合上述规律,由此推测靛蓝降解产物组成复杂,靛红是主要产物,此外可能有其他中间产物生成。

图5 不同光照条件下靛蓝色素DMF溶液中靛蓝和靛红含量的变化Fig.5 The indigo and isatin concentration changes in the indigo DMF solution under different light conditions

2.3.2 不同温度下靛蓝色素溶液色度和物质含量的变化 实验研究了不同温度对靛蓝色素DMF溶液稳定性的影响。由图6可知，色度变化监测结果为不同温度条件下,靛蓝色素DMF溶液颜色变化速率呈显著性差异(p<0.05),4 ℃下靛蓝溶液色度变化受到显著抑制,室温条件下靛蓝溶液色度变化缓慢,而37 ℃下色度变化速度明显加快,但后期变化较慢,具体原因仍待进一步确认。由图7可知，物质含量的变化情况与光照条件下检测结果相似,靛蓝的降解与靛红的生成同步发生,但其变化量无对应关系,表明靛蓝降解产物包括靛红等多种成分。4 ℃下,靛蓝色素降解速率和靛红合成速率最低,30 h之前,随着温度的增加,速率明显加快,30 h之后,室温条件下的反应速率明显高于37 ℃下反应速率,该结果与色度变化实验一致,具体原因仍待进一步确认。

图6 不同温度下靛蓝色素DMF溶液色度的变化Fig.6 The colourity change of the indigo DMF solution at different temperature

图7 不同温度下靛蓝色素DMF溶液中靛蓝和靛红含量的变化Fig.7 The indigo and isatin concentration changes in the indigo DMF solution at different temperature

3 结论

本研究利用基因工程技术,通过异源表达苯乙烯单加氧酶基因styAB,构建了高产靛蓝色素大肠杆菌工程菌E-AB与野生型靛蓝合成菌株对比,E-AB靛蓝色素最高产量为68.9 mg/L,较野生型菌株最高产量提高约5.4倍,说明大肠杆菌可进一步提高靛蓝色素合成产量。进一步研究了光照和温度等环境因素对微生物产靛蓝色素稳定性的影响。结果表明,避光和低温条件下,靛蓝色素稳定性较好,而高温和紫外光等条件则加剧靛蓝色素的降解。通过检测靛蓝色素降解过程中物质含量和色度的变化,发现靛红是靛蓝色素降解的主要产物之一。综上所述,靛蓝色素的稳定性与环境因素密切相关,其降解机制复杂,仍有待进一步研究。

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ConstructionofgeneengineeredEscherichiacolistrainforhigh-yieldproductionofindigoanditsstability

DULing-yan1,2,ZHANGCe3,CHEYi-xin1,LIUWen-xian1,WANGMeng-fei1,YINSheng1,2,*,WANGCheng-tao1,2,*

(1.Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Technology & Business University,Beijing 100048,China;2.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology & Business University,Beijing 100048,China; 3.Beijing Economic Management School,Beijing 100142,China)

As the natural food blue pigment sources are comparatively rare,microbial fermentation is an efficient way to produce the natural indigo pigment. In this study,the styrene monooxygenase genestyABwas cloned fromPseudomonasputidaB3 and then over-expressed inEscherichiacoli,generating the gene engineered strain E-AB for high-yield production of indigo. By fermentation conditions optimization,a maximum yield of 68.9 mg/L of indigo was obtained in E-AB using indole as the substrate,which was 5.4-fold higher than that of wild-type strain B3. The indigo stability was further investigated under different temperature and illumination conditions. High temperature and UV light obviously enhanced indigo degradation,while low temperature and light-proof condition could delay indigo degradation. And it was detected that isatin was the main degradation compound during indigo degradation. These results would provide the theoretical support and technical guidance for high efficient biotransformation preparation and application of the natural indigo pigment.

indigo;gene engineered strain;styrene monooxygenase;fermentation;pigment stability

2017-02-07

杜灵燕(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物与发酵技术，E-mail：283604024@qq.com。

*通讯作者:尹胜(1983-)，男，博士，副教授，研究方向：食品微生物与发酵技术、食品安全，E-mail：yinsheng@btbu.edu.cn。 王成涛(1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：wct5566@163.com。

国家自然科学基金项目(31401669,31571801)；北京市自然科学基金项目(5154027)；2016年度大学生科学研究与创业行动计划项目(19008001131)。

TS202.3

:A

:1002-0306(2017)16-0229-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.043