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(四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610025)

响应曲面法优化超声波辅助提取黑果枸杞中花青素工艺

姚思敏蔷,单虹宇,于雅静,吕远平*

(四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610025)

采用超声波辅助提取黑果枸杞中花青素,以花青素得率为评价指标,研究黑果枸杞中花青素的提取工艺。在单因素实验基础上,选取乙醇体积分数、液料比、提取温度和提取时间四个显著影响因素,并利用响应曲面法优化黑果枸杞花青素的提取工艺。结果表明,最佳提取方法为:乙醇体积分数72%、液料比27∶1 (mL/g)、提取时间16 min、提取温度38 ℃。在此条件下花青素平均得率为(9.16±0.059) mg/g，与预测值相比其相对误差为0.43%。与未用超声波辅助提取方法相比,得率增加了近1倍,且用时较短。

黑果枸杞,花青素,超声波辅助提取,响应曲面法

黑果枸杞(LyciumruthenicuMurr)为茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.),是民族医药常用药材[1],为多年生野生灌木,主要分布于西北及西藏等荒漠地区[2]。研究表明,成熟的黑果枸杞含有丰富的花青素(Anthocyanidins),所含花青素含量分别为蓝莓、紫甘蓝、紫薯、葡萄的1.75、1.91、4.45、10.72倍[3]。研究发现,花青素具有较强的抗氧化活性,具有改善心血管疾病、防止脑神经老化、预防癌症等多种生理功能[4-6]。

目前常见的黑果枸杞色素提取方法有有机溶剂提取法、超临界流体萃取法、微波辅助提取法、酶辅助提取法和超声波辅助提取法。有机溶剂提取法存在耗时长、提取率低、溶剂残留等问题;超临界流体萃取法生产成本较高,适用范围较窄;微波辅助提取法提取杂质较多,设备要求高;酶法提取时酶和色素难以分离[7]。超声波辅助提取法是借助超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应来强化提取过程,从而提高物质的提取率,具有效率高、时间短、成本低、提取量大、无需加热等特点[8],同时可以避免高温对提取成分的影响。因此本实验利用超声波辅助提取黑果枸杞中花青素,并采用响应曲面法对提取工艺进行优化[9],以期获得黑果枸杞花青素的最佳提取工艺,为其资源的深度开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

新疆黑果枸杞 新疆乌鲁木齐水磨沟区西域百草汇;氯化矢车菊素标准品 四川省维克奇生物科技有限公司;盐酸、无水乙醇等 均为分析纯,成都科龙化工试剂厂。

410HT型超声清洗机 深圳科利尔电子科技有限公司;ESJ210-4A型电子天平 沈阳龙腾电子有限公司;UV-2000型紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;LD-Y300A型粉碎机 永康顶帅五金制品有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 花青素检测中标准曲线的绘制 以试剂空白(乙醇)为参比,对黑果枸杞色素提取液在180～800 nm处进行光谱扫描,花青素提取液在545 nm处有明显特征吸收,利用与黑果枸杞色素提取液的强吸收峰一致的氯化矢车菊素作为标准品。用紫外-可见分光光度计测定氯化矢车菊素在180～800 nm波长范围内的紫外可见光光谱性质。配制0.1 mg/mL的氯化矢车菊素标准溶液,分别移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于50 mL容量瓶中,用pH1.0、体积分数75%的乙醇溶液定容,即配制成1、2、3、4、5 μg/mL的氯化矢车菊素标准溶液。在545 nm处检测吸光度值,绘制出氯化矢车菊素标准曲线,并得出回归方程。

1.2.2 花青素得率测定 吸取1 mL花青素提取液,用pH 1.0、体积分数75%的乙醇溶液稀释30倍,测定溶液在545 nm处的吸光度值,根据氯化矢车菊素标准曲线方程计算样液中的花青素含量。连续测定三次,取三次实验结果平均值作为样品中花青素含量。花青素得率计算公式如下:

式中:m为称取干燥后的黑果枸杞粉质量,g;V为花青素提取液体积,mL;n为稀释倍数;c为回归方程计算得出的测试样液中花青素浓度,μg/mL。

1.2.3 超声波辅助提取 将晒干的黑果枸杞去梗后打碎成粉,过60目筛,40 ℃干燥12 h备用。称取1.00 g黑果枸杞粉置于100 mL锥形瓶中,按照液料比30∶1 (mL/g)加入pH 3.0、体积分数75%的乙醇溶液,在40 ℃下超声(超声功率为240 W)提取20 min,真空抽滤后将滤液用相应提取剂定容至100 mL容量瓶中制成花青素提取液备用。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 溶剂种类对花青素得率的影响 分别选取酸性的水、乙醇、甲醇、丙酮作为提取溶剂,其他条件同1.2.3所示进行单因素实验,考察溶剂种类对花青素得率的影响。

1.2.4.2 溶剂体积分数对花青素得率的影响 分别选取体积分数为65%、70%、75%、80%、85%、90%的酸性溶液作为提取溶剂,其他条件同1.2.3所示进行单因素实验,考察溶剂体积分数对花青素得率的影响。

1.2.4.3 液料比对花青素得率的影响 分别选取液料比为15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 (mL/g),其他条件同1.2.3所示进行单因素实验,考察液料比对花青素得率的影响。

1.2.4.4 提取时间对花青素得率的影响 分别选取提取时间为5、10、20、30、40、50、60 min,其他条件同1.2.3所示进行单因素实验,考察提取时间对花青素得率的影响。

1.2.4.5 提取温度对花青素得率的影响 分别选取提取温度为20、30、40、50、60、70 ℃,其他条件同1.2.3所示进行单因素实验,考察提取温度对花青素得率的影响。

1.2.4.6 pH对花青素得率的影响 分别选取pH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0,其他条件同1.2.3所示进行单因素实验,考察pH对花青素得率的影响。

1.2.4.7 提取次数对花青素得率的影响 将真空抽滤后的滤渣提取1、2、3、4、5次,其他条件同1.2.3所示进行单因素实验,考察提取次数对花青素得率的影响。

1.2.5 响应面优化实验 在单因素实验中,液料比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度对花青素提取影响较大,因此选取这四个因素进行响应面优化实验[10-12],以花青素得率为评价指标,优化超声波提取黑果枸杞花青素的最佳工艺条件。实验设计中的水平及编码表见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiments

1.3数据处理

采用Origin 8.0对单因素实验数据进行处理,利用响应面设计软件Design Expert 9.0进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1花青素检测

2.1.1 氯化矢车菊素的紫外吸收特征 由图1可知,氯化矢车菊素标准溶液在204、280～310和545 nm处均有吸收峰,由于204及280～310 nm为近紫外光区,该波长下的显色基团较多,而545 nm在可见光范围内且吸光度值也较高,同时检测黑果枸杞提取液在545 nm处有明显的特征吸收,因此选取545 nm为检测波长。

图1 氯化矢车菊素光谱曲线Fig.1 Spectrum curve of cyanidin chloride

2.1.2 氯化矢车菊素的标准曲线 氯化矢车菊素标准曲线的回归方程:A=0.1685c+0.0059,R2=0.99987。式中:A-吸光度,c-氯化矢车菊素浓度,μg/mL。基于最小二乘法对氯化矢车菊素标准液的浓度和吸光度的结果做线性回归分析。得到其标准曲线见图2。图中氯化矢车菊素的吸光度随其浓度变化呈线性增加关系,相关度系数较高,表明氯化矢车菊素溶液吸光度的变化可以很好地反映溶液中氯化矢车菊素浓度的变化。

图2 氯化矢车菊素标准曲线Fig.2 Standard curve of cyanidin chloride

2.2单因素实验

2.2.1 溶剂种类对花青素得率的影响 当利用酸性的水、甲醇、乙醇和丙酮作为提取溶剂时,所得黑果枸杞花青素得率如图3所示。甲醇和乙醇提取效果优于水和丙酮,但因甲醇具有毒性,乙醇较为安全且价格最为低廉,因此选择乙醇作为适宜的提取溶剂来提取,并进一步探究出适宜的乙醇溶剂的体积分数。

图3 溶剂种类对花青素得率的影响Fig.3 Effect of solvent type on anthocyanin yield

2.2.2 乙醇体积分数对花青素得率的影响 由图4可知，在实验范围内,花青素得率随着乙醇体积分数的增加先升高后下降。这可能由于花青素在植物体内以氢键和疏水键与蛋白质、多糖等物质相连,有机溶剂可以促进氢键的断裂,从而变为小分子溶解到溶剂中[13]。而随着乙醇体积分数的增加,可能会溶解出醇溶性杂质,争夺与花青素结合的乙醇-水分子,从而使花青素得率下降[14]。因此选择75%作为黑果枸杞花青素提取的适宜体积分数。

图4 乙醇体积分数对花青素得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on anthocyanin yield

2.2.3 液料比对花青素得率的影响 由图5可知,在液料比为30∶1 (mL/g)时,黑果枸杞中的花青素充分溶出,此时的花青素得率最高,后随着液料比持续增加,曲线趋于平缓(略有降低)。这是因为继续增大液料比也无法推动花青素的进一步溶出,反而可能会使一些醇溶性杂质溶出抢夺乙醇-水分子,从而影响花青素溶解于溶剂中,使花青素得率略有下降。因此选定液料比30∶1 (mL/g)作为黑果枸杞花青素提取的适宜液料比。

图5 液料比对花青素得率的影响Fig.5 Effect of liquid-to-solid ratio on anthocyanin yield

2.2.4 提取时间对花青素得率的影响 根据图6可知,花青素得率上升至提取时间为20 min时达到最高点,当大于20 min后花青素得率下降。超声波产生的空化作用可以破坏黑果枸杞细胞壁,增加溶剂穿透力,使溶剂充分、快速渗透到细胞内部,有效溶解花青素。但超声时间过长,可能会对花青素的结构造成影响,使花青素得率下降[15];而超声时间较短时,部分花青素还未溶出。因此选取提取时间10～30 min这一适宜范围。

图6 提取时间对花青素得率的影响Fig.6 Effect of extraction time on anthocyanin yield

2.2.5 提取温度对花青素得率的影响 由图7可知,当提取温度为40 ℃时花青素得率达到最大。这可能是由于温度的升高,分子热运动速率加快,溶质的溶解速率随之加快,溶解度亦会增加。但花青素对热较为敏感,温度过高可能对花青素的稳定性造成影响,使其分解,得率有所下降。因此选定30～50 ℃作为适宜的提取温度范围。

图7 提取温度对花青素得率的影响Fig.7 Effect of extraction temperature on anthocyanin yield

2.2.6 pH对花青素得率的影响 图8显示pH对花青素得率的影响。花青素呈弱酸性,在酸性条件下稳定性比较强,花青素得率较高,但是pH过低,花青素易离解成离子状态,造成过滤困难,损失较大。当pH为3.0时花青素得率达到最大。因此选取pH3.0作为适宜的提取剂pH。

图8 pH对花青素得率的影响Fig.8 Effect of solvent pH on anthocyanin yield

2.2.7 提取次数对花青素得率的影响 图9为提取次数对花青素得率的影响。提取一次得到的花青素为9.03 mg/g,提取率达到94.5%,表明提取一次就可以把花青素基本全部提取出来。

图9 提取次数对花青素得率的影响Fig.9 Effect of extraction number on anthocyanin yield

2.3响应面优化实验设计

在单因素实验的基础上,选取对乙醇提取花青素得率影响显著的四个因素(液料比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度)进行响应面优化实验,以花青素得率为评价指标,确定超声波提取黑果枸杞花青素的最佳工艺条件。Box-Behnken实验设计[16-19]及结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Results of response surface experiments

表3 回归方程方差分析结果Table 3 Analysis results of regression and variance

注:**p<0.01为极显著;*p<0.05为显著。

图10 液料比和乙醇体积分数对花青素得率影响的响应面图Fig.10 Response surface plot showing the interactive effects of liquid-to-solid ratio and ethanol concentration on anthocyanin yield

根据回归方程,做出响应面分析图,各因素的交互作用见图10～图15。从图中可以看出各因素在提取过程中的交互作用,响应面图的曲面越陡,交互作用越显著,反之越不显著[20]。比较图10～图15可知,图10～图13曲面较陡,表明液料比(A)和乙醇体积分数(B)、液料比(A)和提取时间(C)、液料比(A)和提取温度(D)、乙醇体积分数(B)和提取时间(C)的交互作用较显著。图14中可以看出提取温度上升的幅度比乙醇体积分数稍陡,说明提取温度对花青素得率的影响较液料比大。图15中提取温度上升幅度明显大于提取时间的上升幅度,说明提取温度对花青素得率影响比提取时间对其的影响大,与方差分析结果一致。

图11 液料比和提取时间对花青素得率影响的响应面图Fig.11 Response surface plot showing the interactive effects of liquid-to-solid ratio and extraction time on anthocyanin yield

图12 液料比和提取温度对花青素得率影响的响应面图Fig.12 Response surface plot showing the interactive effects of liquid-to-solid ratio and extraction temperature on anthocyanin yield

图13 乙醇体积分数和提取时间对花青素得率影响的响应面图Fig.13 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction time on anthocyanin yield

图14 乙醇体积分数和提取温度对花青素得率影响的响应面图Fig.14 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and extraction temperature on anthocyanin yield

图15 提取时间和提取温度对花青素得率影响的响应面图Fig.15 Response surface plot showing the interactive effects of extraction time and extraction temperature on anthocyanin yield

在模型浓度范围内选择出发点,使用快速上升法进行优化得到的黑果枸杞花青素提取的最佳方法为:乙醇体积分数72.11%、液料比27.21∶1 (mL/g)、提取时间15.92 min、提取温度38.21 ℃,花青素理论得率9.20 mg/g。考虑到实际操作,将提取工艺参数修正为乙醇体积分数72%、液料比27∶1 (mL/g)、提取时间16 min、提取温度38 ℃。以上述条件进行3次验证实验,花青素得率为(9.16±0.059) mg/g,与理论花青素的得率相比,其相对误差为0.43%,表明模型可靠。

2.4超声波辅助提取法与乙醇溶剂提取法比较

在乙醇体积分数、液料比、提取温度相同的条件下,采用乙醇溶剂提取法提取黑果枸杞中的花青素2 h,花青素得率为(4.71±0.032) mg/g。而超声波辅助提取的花青素得率为(9.16±0.059) mg/g,得率为前者的将近2倍,且比溶剂提取法缩短了100 min。由此可知,超声波辅助提取法是一种高效省时的花青素提取方法。

3 结论

响应曲面法优化超声波辅助乙醇提取黑果枸杞中花青素的最优方案为:乙醇体积分数72%、液料比27∶1 (mL/g)、提取时间16 min、提取温度38 ℃,花青素实际得率为(9.16±0.059) mg/g,与理论花青素的得率为测值相比,其相对误差为0.43%。用乙醇溶剂提取法得到的花青素得率为(4.71±0.032) mg/g,得率仅为超声波辅助提取的一半左右,且耗时较长。表明超声波辅助提取技术具有耗时短、效率高等优点,可为今后黑果枸杞花青素的提取提供参考依据。

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Optimizationofultrasonic-assistedextractionprocessforanthocyaninsfromLyciumruthenicuMurrbyresponsesurfacemethodology

YAOSi-minqiang,SHANHong-yu,YUYa-jing,LVYuan-ping*

(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610025,China)

Response surface methodology was employed for the ultrasonic-assisted extraction of anthocyanins fromLyciumruthenicuMurr. Anthocyanin yield was selected as evaluation index to investigate anthocyanin extraction process fromLyciumruthenicuMurr. On the basis of one-factor-at-a-time experiments,response surface methodology was used to optimize the extraction process of anthocyanins fromLyciumruthenicuMurr with four significant impact factors such as ethanol concentration,liquid-to-solid ratio,extraction time,extraction temperature. The results showed that the optimum conditions were as follows:72% of ethanol concentration,27∶1 (mL/g)of liquid-to-solid ratio,16 min of extraction time,38 ℃ of extraction temperature. Under these conditions,the actual average yield was(9.16±0.059)mg/g,relative error of 0.43% compared with the predicted value and incresed nearly 1-fold compared with that obtained without ultrasonic treatment.

LyciumruthenicuMurr;anthocyanins;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

2017-01-15

姚思敏蔷(1993-)，女，硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail:747294934@qq.com。

*通讯作者:吕远平(1971-)，女，博士，教授，研究方向：食品科学与工程，E-mail:364943477@qq.com。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)16-0210-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.039