,,,4,,3,,3,*

(1.中国科学院上海高等研究院,上海 201210;2.中国科学院大学,北京 100049;3.上海科技大学,上海 201210;4.上海大学,上海 200444)

N-乙酰神经氨酸合成途径在枯草芽孢杆菌的构建

李思杰1,2,3,纪明华1,赵利超1,4,史吉平1,3,孙俊松1,3,*

(1.中国科学院上海高等研究院,上海 201210;2.中国科学院大学,北京 100049;3.上海科技大学,上海 201210;4.上海大学,上海 200444)

对食品安全认可的枯草芽孢杆菌进行菌株改造,利用生物发酵法制备N-乙酰神经氨酸。首先通过基因合成获取来自枯草芽孢杆菌溶源体的Pholin启动子并构建了pMK4-Pholin-GFP质粒,转入枯草芽孢杆菌,以GFP为报告基因,对Pholin及其它常见的强启动子进行了转录效率的比较,然后将优化后的Pholin用于构建N-乙酰神经氨酸表达质粒pMK4-Pholin-neuBC。研究结果显示:Pholin启动子是一种优异的枯草芽孢杆菌组成型强启动子,在利用LB进行发酵培养的实验中,Pholin的转录效率为同样方式构建下的P43启动子的2.62倍。通过N-乙酰神经氨酸表达质粒,可以成功地在枯草芽孢杆菌168菌株中实现N-乙酰神经氨酸的重组生产,摇瓶培养中N-乙酰神经氨酸的产量为0.226 g/L。本文为枯草芽孢杆菌进行N-乙酰神经氨酸的工业化发酵生产奠定了研究基础。

启动子,N-乙酰神经氨酸,枯草芽孢杆菌

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)能促进大脑发育,具有改善人体记忆力、抗病毒等功效,在食品保健品和医药领域均有重要的用途[1]。但是,N-乙酰神经氨酸单体的制备成本较高,因此近年来多种微生物被用于N-乙酰神经氨酸的外源生产,如大肠杆菌通过外源表达UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因(neuC)和N-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB),并通过敲除相关的基因已经可以高产Neu5Ac[2],但大肠杆菌作为革兰氏阴性菌,在发酵过程中会积累大量的内毒素[3]。因此,利用食品安全领域认可的枯草芽孢杆菌进行Neu5Ac的发酵生产具有重要的研究和应用前景。

表1 菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids

枯草芽孢杆菌对营养的要求不高,生长迅速,发酵密度高,其微生物菌体或发酵产品在食品和制药领域均有广泛的应用价值[4];枯草芽孢杆菌在外源蛋白生产时,不仅表达量高,还可借助强大的分泌系统进行分泌表达,可以大大降低外源蛋白的分离成本,因此是许多食品工业用酶的首选宿主细胞。但枯草芽孢杆菌的遗传操作不如大肠杆菌便捷高效,然而近年来枯草芽孢杆菌表达系统得到了全面的提升,无论遗传工具还是宿主细胞生产性能的优化,均取得了大量成果,可使用的遗传工具逐步增多,为枯草芽孢杆菌的改造创造了条件。枯草芽孢杆菌168菌株为实验室常用的菌株,其转化效率较高,遗传及代谢图谱比较清晰;与其相近的枯草芽孢杆菌164菌株(ATCC 6051a)基因组序列也已公开,对于外源蛋白具有更好的分泌效果,但转化操作不及168菌株[5]。本实验室通过将comk基因[6]整合到枯草芽孢杆菌164菌株中,利用comk的诱导表达将164菌株的转化效率提高了千倍以上,得到了具有更高转化效率的枯草芽孢杆菌164S菌株。

此外,在枯草芽孢杆菌表达系统的优化过程中,高效启动子的搜寻、验证和应用一直是一项十分重要的研究内容,尽管有不少已被工业应用,如P43、PxylA、PamyQ、P1398等[7-8],但是由于蛋白种类及基因大小、蛋白折叠等各方面的差异性,仍然需要更多不同的高效启动子以满足不同重组生产菌株构建的需要。研究发现含Φ105前噬菌体的枯草芽孢杆菌168溶源菌,因为噬菌体强大的表达元件,在工业酶生产菌株的构建中得到应用[9],而Φ105是一类温和的噬菌体,可以作为载体,高效而特异地将外源基因整合到枯草芽孢杆菌168菌株[10]。Yun-Chung Leung等将Φ105噬菌体Holin蛋白编码区进行了改造,使其具有插入外源基因表达外源蛋白的性能[11]。为了避免完整噬菌体基因组DNA引入细胞后带来的菌株裂解的风险,在本研究中,分离了Pholin启动子,并对其核心序列进行了优化,将基因合成后的启动子克隆到质粒pMK4-GFP载体中,以GFP的激发荧光量为标记,进行Pholin与P43、P1398及PxylA的转录效率的对比;并将N-乙酰神经氨酸合成酶(neuB)和UDP-G1cNac 2-差向异构酶(neuC)的基因克隆到Pholin之后,构建了Neu5Ac的合成途径,利用枯草芽孢杆菌进行了Neu5Ac的重组表达。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

实验中用到的质粒及菌种 均见表1;枯草芽孢杆菌培养的LB培养基 酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化钠10 g/L;Neu5Ac合成发酵所用的甘油培养基 甘油40 g/L,氯化铵4.0 g/L,氯化钾2.5 g/L,硫化镁0.9 g/L,胰蛋白胨2.5 g/L,碳源中所用的甘油可由10～20 g/L的葡萄糖所代替;限制性内切酶PstI、EcoRI、XmaI 购自赛默飞世尔公司;Taq DNA聚合酶及Primer star 购自宝生物工程(大连)有限公司;木糖及N-乙酰神经氨酸标准品 购自国药集团化学试剂有限公司;PCR清洁试剂盒、质粒小剂量提取试剂盒等 来自杭州爱思进生物技术有限公司;One Step Cloning Kit 购自南京诺唯赞生物科技有限公司;DNA测序及合成 由上海生工生物工程公司完成。

Synergy H1型酶标仪 美国Bio Tek公司;S1000型PCR仪器 美国BIO-RAD公司;HE90型DNA凝胶电泳系统 上海天能公司;RID-10A/SPD-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2实验方法

图1 Pholin启动子序列Fig.1 Alignment of DNA sequences of Pholinpromoters注:序列中上一行为优化后的,下面的一行为原始启动子序列,加粗的序列为Xma I位点,方框中所列的为修改前后的保守区启动子序列,其中“.”为碱基缺失位点。

1.2.1 Pholin启动子序列的优化和构建 Pholin启动子存在两个明显的由-35和-10组成的双启动区,第一个启动区的-35区域的TAAACA在设计中替换为更经典的TTGACA,而-10区域TTTTAT碱基序列替换为TATAAT;再将第二个启动区域的-35区域TAGACA碱基序列替换为TTAGCA,而-10区域TTGAG被更改为TATAAT,如图1所示。优化后的Pholin启动子序列送交公司进行DNA合成,并TA克隆到pUC57载体上,该启动子Pholin还设计了XmaI位点(图1中黑色粗体字)用于启动子的克隆,以完成GFP表达质粒pMK4-Pholin-GFP及N-乙酰神经氨酸合成途径表达质粒pMK4-Pholin-neuBC的构建。

1.2.2 Pholin启动子表达效率验证 不同启动子以相同的方式克隆到pMK4质粒上,将构建的五种表达质粒pMK4-GFP、pMK4-Pholin-GFP、pMK4-P1398-GFP、pMK4-PxylA-GFP及pMK4-P43-GFP分别转入枯草芽孢杆菌164S菌株[13]。其中,质粒pMK4-GFP携带表达GFP的基因,但是不含启动子元件。分别挑取3～5个不同的转化子,进行摇瓶发酵并测定GFP蛋白荧光表达量。在摇瓶发酵时,将种子液按照1%的比例接种于装有50 mL发酵培养基的500 mL的三角瓶中,37 ℃,200 r/min振荡连续培养48 h,每间隔4 h进行取样,测定细胞的生物量和GFP荧光强度。

细胞的生物量的测定方法:将发酵培养液经过连续倍比稀释后,测量OD600值,并将获得的0.3～0.5区间的值乘以稀释倍数得到样品的准确OD600,以此作为生物量进行对比。

GPF荧光测定方法:对摇瓶发酵菌液进行取样,菌液经梯度稀释100倍后用于GFP的荧光检测。取200 μL稀释后的菌液置于96孔板中,放入酶标仪进样器中开始荧光测定,测量时选择荧光检测模式,读数类型选择“endpoint”,设定激发光波长为485 nm,检测光波长为520 nm,设定测量温度30 ℃。

1.2.3 Neu5Ac合成菌株的构建 含有neuB及neuC的DNA片断通过基因合成获得,以质粒pUC57-neuBC为DNA模板,所需引物分别为neuF1:GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCCTATCATTTTATAT CCTTAAAAACTTTTTGTGTGC,以及neuR1:GGGGG CAGTTTAGAACCCGGGTAACAAGGAGGAATAAAAA ATGAAAGAAATAAAAATAC;质粒pMK4-Pholin-GFP进行XmaI/EcoRI 双酶切并经清洁后,按1∶3的比例和纯化后的PCR产物进行一步法克隆(InFusion Cloning),所用试剂盒为One Step Cloning Kit,电转感受态大肠杆菌DH5α后[14],经酶切和测序验证获得neuBC的表达质粒pMK4-Pholin-neuBC,再以电转化的方法将该质粒转入枯草芽孢杆菌168中[15],构建N-乙酰神经氨酸的重组生产菌株。

1.2.4 Neu5Ac合成的发酵 Neu5Ac摇瓶发酵时,先挑取3个不同的重组子单克隆,接入LB种子培养基,再将种子液以1%体积比接种至装有50 mL发酵培养基的500 mL的三角瓶中,37 ℃,200 r/min振荡培养48 h。在第一批发酵数据收集时,加入甘油的含量为20 g/L,但由于细胞生长缓慢,对培养基的碳源进行了替代优化;第二批发酵数据收集时,一组发酵培养基,将甘油的含量补加至40 g/L;另一组,将甘油替换为1%含量的葡萄糖。

1.2.5 液相色谱测定Neu5Ac含量 利用液相色谱测定Neu5Ac产量,所用色谱柱为Aminex HPX-87H柱,检测器为岛津RID-l0A型示差检测器,检测参数设定为流动相为5 mmol/L H2SO4,流速为0.8 mL/min,柱温为65 ℃,进样量为20 μL。先进行N-乙酰神经氨酸标准曲线的绘制。具体为,称量Neu5Ac标品,用去离子水稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L五个浓度,根据上述条件进行分析。收集数据后,以Neu5Ac浓度为纵坐标Y轴,对应的液相色谱峰面积为横坐标X值,绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为Y=0.00000544X+0.0171,相关系数R2=0.9999107。收集的发酵液样品,12000 r/min离心5 min,取20 μL上清液以同样的方法进行测定,并根据公式将峰面积换算得出Neu5Ac的浓度。

2 结果与分析

2.1含Pholin启动子的表达质粒构建

Pholin在枯草芽孢杆菌中并没有被单独使用过,根据其序列的特点,针对引发高效转录的两个保守区,均进行了序列优化(图1),然后将设计的启动子序列送交生物公司进行了DNA合成,并TA克隆到载体pUC57上,将pUC57-Pholin和携带启动子P43的质粒pMK4-P43-GFP同时进行限制性内切酶PstI和XmaI消化,酶切片断以试剂盒清洁后进行连接,构建了pMK4-Pholin-GFP质粒(图2左半部分所示);neuBC同样经基因合成并TA克隆到载体pUC57上,并以pUC57-neuBC为模板获得含neuBC的PCR产物,该DNA与经XmaI/EcoRI酶切的质粒pMK4-Pholin-GFP进行一步法克隆(图2右半部分所示),得到表达N-乙酰神经氨酸合成途径的质粒pMK4-Pholin-neuBC。

图2 表达质粒pMK4-Pholin-GFP和pMK4-Pholin-neuBC的构建Fig.2 Construction of pMK4-Pholin-GFP and pMK4-Pholin-neuBC

2.2 Pholin启动子表达效率的比较研究

图3 绿色荧光蛋白在LB培养基中的表达以及生物量的变化曲线Fig.3 The profile of cellular biomass and emitted GFP fluorescence of recombinant cells cultivated in LB broth

将分别转化了pMK4-GFP、pMK4-Pholin-GFP、pMK4-P1398-GFP、pMK4-PxylA-GFP及pMK4-P43-GFP质粒的枯草芽孢杆菌164S重组菌株,进行连续培养,测定细胞的OD600值和GFP荧光强度。图3(a)结果清晰地显示,含pMK4-GFP的重组菌,因质粒不含启动子,发酵过程中,荧光值一直很低;而其它重组菌均表达了大量的GFP,但是菌液在稀释后测得的荧光值显示,48 h时Pholin启动子带来的荧光表达强度值为55799.0 a.u.,与其他启动子横向比较,为PxylA启动子的4.28倍,P43启动子的2.62倍,P1398启动子的1.88倍。由此可以证明Pholin启动子是一个非常优异的组成型强启动子,其启动效应强于传统的组成型P43启动子及诱导型PxylA和P1398启动子。此外,由生物量测定曲线可看出,摇瓶发酵培养24 h后,枯草芽孢杆菌164S重组菌开始进入延滞期,GFP的表达也趋近于饱和,荧光增加开始放缓,说明Pholin启动子的转录模式为典型的组成型方式。图3(b)所示,携带不同质粒的重组枯草芽孢杆菌的生长和细胞数几乎完全一致,在0～28 h细胞持续增殖,而在32 h之后OD600逐渐下降。但摇瓶发酵过程中GFP的荧光值却呈现不一样的变化,但基本趋势是随着发酵时间的延长,实时荧光量不断增加,这是由于GFP蛋白与细胞的衰竭速率不一致造成的。

2.3 N-乙酰神经氨酸的表达研究

利用Neu5Ac合成途经的重组菌株进行摇瓶发酵,所用的培养基以甘油为碳源,这是由于前期实验数据表明,在类似的培养基中,以甘油为碳源可以产生较高的N-乙酰神经氨酸。如图4(a)所示,N-乙酰神经氨酸的表达量,随着发酵时间的延长而增大,在36 h左右达到最大值,浓度为0.226 g/L。利用微生物发酵法,重组大肠杆菌Neu5Ac的产量在高密度发酵时可以达到7.85 g/L[16],而在枯草芽孢杆菌重组菌的高密度发酵中,Neu5Ac的产量的提高也不多(数据未显示),因此推测枯草芽孢杆菌存在可能的Neu5Ac分解代谢途径,未来将从分析枯草芽孢杆菌的代谢网络调控方面着手,通过Neu5Ac分解旁路途径的敲除来提高Neu5Ac的发酵产量。此外,如图4(b)所示,在1.0%甘油为碳源的培养基中,重组168菌株的细胞量出现增长缓慢的现象,发酵液的最高OD600低于1.2,推测可能是由于Pholin启动子的高转录水平给宿主细胞带来尚不知原因的代谢负担,而当培养基中的碳源更换成1.0%葡萄糖时,菌株的最高OD600可以提高到3～4之间,但是还是没法达到如图3(b)所示的164重组菌株的细胞量。而且,将主要碳源更换成葡萄糖,或者以164为宿主细胞进行发酵,这两种措施均可以提高细胞的生物发酵量,但是Neu5Ac的合成量却更低(数据未显示),提示neuBC转录水平的高低可能不是影响Neu5Ac合成量的关键因素。因此,有必要在未来把Pholin启动子构建到其它外源蛋白的表达系统中,通过与已知高效生产菌株的比较及分析,以进一步提升该启动子在芽孢杆菌菌株设计及优化中的应用前景。

图4 枯草芽孢杆菌168菌株发酵生产N-乙酰神经氨酸的产量和生物量积累Fig.4 The yield of Neu5Ac by recombinant Bacillus subtilis 168 and its growth curve in shaking flasks

3 结论

以开发更高效食品工业酶的枯草芽孢杆菌表达系统为目的,以来自噬菌体的Pholin为目标,运用序列优化、基因合成的方式进行分子改造,并以GFP为报告蛋白,证明从前噬菌体分离出的Pholin启动子具有很强的启动效应;还构建了N-乙酰神经氨酸的合成途径,通过neuBC的表达,使枯草芽孢杆菌得以合成Neu5Ac,其在摇瓶发酵中产量达到了0.226 g/L。同时研究中还发现,neuBC的强表达会导致宿主细胞的高密度生长受限,提示组成型强表达的neuBC可能不是提高Neu5Ac产量的关键因素,因此后续研究中将对Pholin进行进一步改造,加入具有IPTG诱导效应的调控序列使其成为诱导型启动子[17],同时开展Neu5Ac重组生产菌株的高密度发酵研究,以大幅提高Neu5Ac的表达水平。

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ConstructionofN-acetylneuraminicacidsynthesispathwayinBacillussubtilis

LISi-jie1,2,3,JIMing-hua1,ZHAOLi-chao1,4,SHIJi-ping1,3,SUNJun-song1,3,*

(1.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3.ShanghaiTech University,Shanghai 201210,China; 4.Shanghai University,Shanghai 200444,China)

Synthesis of N-acetylneuraminic acid usingBacillussubtilisis favorable due to high expression level and the fact thatB.subtilismeets the strict safety criteria for application in food industry. In this study,a recombinantBacillussubtiliswas constructed and used for fermentation studie in N-acetylneuraminic acid production. First,a unique promoter Pholinoriginated fromB.subtilislysogen was optimized for heterologous transcription,which level was evaluated by comparison study together with other promoters routinely used inBacillus. The results showed that GFP fluorescence level from recombinant strain containing plasmid pMK4-Pholin-GFP was 2.62 times of that obtained by promoter P43. The acetylneuraminic acid expression cassetteneuBCwas then inserted behind Pholinin pMK4 to construct pMK4-Pholin-neuBC,which was transformed intoB.subtilis168. The recombinantB.subtiliswas able to produce up to 0.226 g/L N-acetylneuraminic acid in fermentation study using shaking flasks,which laid a solid basis for further strain optimization and industrial production of N-acetylneuraminic acid.

promoter;N-acetylneuraminic acid;Bacillussubtilis

2017-02-13

李思杰(1988-)，男，硕士研究生，研究方向：酶工程与生物化工，E-mail：lixuan7707@sina.com。

*通讯作者:孙俊松(1974-)男，博士，研究员，研究方向：酶工程与生物化工，E-mail：sunjs@sari.ac.cn。

上海市科委长三角技术联合攻关领域项目(15295810600)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)16-0131-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.025