(乳业生物技术国家重点实验室,上海乳业生物工程技术研究中心,光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海 200436)

类芽孢杆菌BD3526在无氮固体培养基上产胞外多糖的研究

徐晓芬

(乳业生物技术国家重点实验室,上海乳业生物工程技术研究中心,光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海 200436)

为了研究Paenibacillusbovissp. nov BD3526在无氮培养基上产的胞外多糖的结构和生物活性,本文制得了其在无氮培养基平板上分泌的胞外多糖,并用离子交换层析法对此胞外多糖进行分离纯化,得到了一个主要组分的纯品(F1);凝胶渗透色谱(GPC)的结果显示F1的分子量是3.76×107Da,用红外光谱(FT-IR)和核磁共振氢谱(1H NMR)表征其化学结构,结果表明F1是直链的左聚糖;热重分析(TGA)和差示扫描量热法(DSC)的结果表明左聚糖具有良好的热稳定性;动态光散射仪(DLS)测定其在水溶液中形成的聚集体的粒径约为163.2 nm,而透射电镜(TEM)照片表明其在水溶液中呈紧实的球型,粒径在50～100 nm;最后采用细胞实验评价其免疫增强作用,体外实验结果表明此左聚糖在低浓度时即可显著促进脾细胞的增殖,具有很强的免疫增强活性。此左聚糖可以作为免疫增强剂应用于功能性食品领域。

胞外多糖,左聚糖,热分析,免疫增强

类芽孢杆菌(Paenibacillus)属于兼性厌氧或严格好氧菌,含有内生孢子。这一种类曾归属在芽孢杆菌属内,随着分子生物学的发展,1993年由Ash等人[1]应用PCR探针技术将原属于Bacillus的11个种分出来,建立了新属,即类芽孢杆菌属,此属的细菌倾向会产生膨胀的、椭圆形的芽孢,并将Paenibacilluspolymyxa(多粘类芽孢杆菌)作为新属的模式种。这个属的细菌大多数来源于土壤,且在医药和农业等领域有重要的应用[2],如多粘类芽孢杆菌因其产具有众多生理功能和生物活性的多糖、细菌素等而备受关注[3-8]。Paenibacillusbovissp. nov BD3526是Gao等人[9]从西藏牦牛奶中分离到的一种类芽孢杆菌,经鉴定发现其是类芽孢杆菌属的一个新种,其在产糖培养基中产的胞外多糖是分子量大于2.6×106Da的直链左聚糖(levan),产量达36.25 g/L,具有免疫增强活性[10]。

大部分微生物胞外多糖具有独特的理化性质和生物活性,如抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、免疫增强等,此外,其生产过程可控、不受天气季节影响,生产周期短,因此,被广泛应用于各个行业。微生物胞外多糖在食品中主要用作增稠剂、稳定剂、胶凝剂和乳化剂,如黄原胶和结冷胶。左聚糖主要来源于微生物发酵,分子量一般在2×06～1×108Da范围内[11],它具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性,还具有较多的生物活性,如抗氧化[12-15]、抗肿瘤[12,16-19]、抗炎[20]、降胆固醇[21]、降血糖[22]等;此外,有研究表明低分子量的左聚糖能促进双歧杆菌特别是青春双歧杆菌的增殖[23],也有文献报道高分子量的左聚糖在经过胃肠道时能被降解成重均分子量为～4000 Da的左聚糖[24],本实验室的前期研究表明从BD3526在产糖培养基中产的左聚糖[10]制备得到的低分子量左聚糖(Mw=4200 Da)能促进双歧杆菌特别是婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌生长[25],因此,左聚糖又可以作为潜在的益生元被应用于功能性食品和保健品等领域。

在前期研究中,发现Paenibacillusbovissp. nov BD3526在无氮培养基平板上生长良好,且其菌落非常黏稠、可拉丝,可能是其分泌高分子量的胞外多糖所致。因此,本文提取并制备该黏性多糖粗品,用离子交换层析进行分离纯化,用凝胶渗稳定色谱(GPC)测定主要组分的分子量及分子量分布,用红外光谱和核磁氢谱表征纯品的结构,发现其是分子量超大的直链左聚糖;用差示扫描量热法(DSC)和热重分析(TGA)进一步表征其热性能,用动态光散射仪(DLS)和透射电镜(TEM)研究其在水溶液中的构象;最后,用MTS法研究其免疫增强活性。本研究进一步丰富了BD3526产的胞外多糖的数据,为将其胞外多糖应用于功能性食品领域提供理论基础,同时也为BD3526作为新资源的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

无氮固体培养基(1 L) 蔗糖10 g,磷酸二氢钾0.2 g,七水合硫酸镁0.2 g,氯化钠0.2 g,二水合硫酸钙0.2 g,碳酸钙5 g,琼脂12 g,上述培养基成分均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris) 国药集团化学试剂有限公司;窄分布标样(PEO24k)和宽分布标样(Dextran73k) 英国Malvern公司;类芽孢杆菌(Paenibacillusbovissp. nov BD3526) 本实验室保藏菌种;DEAE-Sepharose Fast Flow GE公司;透析袋 MWCO 14000 Da,华美生物工程公司;BALB/C小鼠 6周龄,雄性,体重(20.0±1.0) g，上海斯莱克动物实验中心;脂多糖(LPS) Sigma;RPMI1640培养液 美国Gibco公司；CellTiter 96 Aqueous One Solution细胞增殖试剂盒 美国Promega公司。

J-30I高效冷冻离心机 Bechman 公司;DHL-A型电脑恒流泵 上海沪西分析仪器厂;TH-500型梯度混合仪 上海沪西分析仪器厂;FreeZone台式冻干机 美国LABCONCO公司;GPC270Max凝胶渗透色谱仪 英国马尔文公司;Nicolet6700傅里叶变换红外光谱仪 Thermo Fisher,USA;Avance III 400 MHz核磁共振仪 德国Bruker公司;JEM-2100透射电镜(TEM) 日本JEOL公司;Heraguard ECO超净工作台 美国Thermo公司;Nano-S动态光散射仪(DLS) 英国Malvern公司;HD-97-1核酸蛋白检测仪 上海金鹏分析仪器有限公司;铜网 北京新网微拓科技有限公司；DSC204F1差示扫描量热仪 德国耐驰仪器制造有限公司；Q600 SDT热重分析仪 美国TA仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 胞外粗多糖的制备 在超净工作台中用接种环蘸取少量新鲜的BD3526种子划到新制备的无氮培养基平板上,将平板放入培养箱中,30 ℃,好氧培养72 h。培养结束后,取出平板,刮取平板上黏稠的菌落(约0.2 g),用蒸馏水将其溶解或分散均匀,离心(12000 r/min,4 ℃,20 min),取上清,然后边搅拌边向上清液中加入质量分数为80%的三氯乙酸溶液至其终质量分数为5%,4 ℃,静置过夜,再离心(12000 r/min,4 ℃,20 min),弃沉淀,取上清,上清液用流动自来水透析24 h(截留分子量14000 Da),然后换用去离子水继续4 ℃透析48 h,每8 h换一次水,冷冻干燥(-80 ℃预冻12 h,冷阱温度-50 ℃,真空度10-3mBar,冻干48 h)得胞外多糖粗品(NEP)。Bradford法[26]检测此胞外多糖粗品中是否含有蛋白。

1.2.2 胞外多糖的分离纯化 胞外多糖粗品用Tris-HCl洗脱缓冲液溶解后(20 mg/mL),经DEAE-Sepharose FF离子交换(D 2.6 cm×30 cm)层析,上样量100 mg,依次用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH7.6)和0.2～1.2 mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱,洗脱速度为3 mL/min,每管收集6 mL,核酸蛋白检测仪在线检测蛋白质含量(紫外A280 nm),用苯酚-硫酸法检测每管中多糖含量(A490 nm),按多糖含量检测值分别合并收集单一组分(Tris-HCl-NaCl洗脱部分未检测到多糖),去离子水透析48 h,每8 h换水一次,将透析液浓缩后冷冻干燥,即得各纯化的样品(F1、F2和F3)。

1.2.3 F1的分子量及分子量分布的测定 用马尔文多检测器GPC测定F1的纯度和分子量及分子量分布。采用马尔文A6000(300 mm×7.8 mm,13 μm)凝胶柱,流动相是0.1 mol/L NaNO3溶液,流速1.0 mL/min,温度35 ℃,进样体积50 μL。用窄分布标样(PEO24k)和宽分布标样(Dextran73k)校正仪器。将F1溶于0.1 mol/L NaNO3溶液,浓度为1 mg/mL,0.22 μm滤膜过滤后进样,洗脱结束后,用马尔文OmniSEC软件计算该样品的分子量及分子量分布。

1.2.4 F1的结构鉴定 用FT-IR和1H NMR表征F1的结构特征:将2.0 mg F1与KBr研磨压片,在4000～500 cm-1区域内进行红外光谱扫描(Nicolet 6700,Thermo Fisher,USA);将10 mg F1溶于1 mL D2O,进行核磁共振仪1H NMR分析,3-(三甲基硅烷)丙酸盐(TSP)作内标,测试温度25 ℃。

1.2.5 F1的热分析 在氮气气氛中,以流量为45 mL/min,升温速度为10 ℃/min,在20～890 ℃温度范围内对F1进行热失重(TGA)和差示扫描量热法(DSC)分析测定。

1.2.6 F1的构象 采用动态光散射仪测定F1多糖在水溶液中的聚集体的粒径大小。用0.22 μm滤膜将F1溶液直接过滤到无尘处理的散射池中,4.0 mW He-Ne激光光源,测定角度为173,激光波长是633 nm,25 ℃恒温测定,数据分析采用仪器自带软件进行。

将F1溶于超纯水中,浓度为2.5 mg/mL,用0.22 μm滤膜过滤,滴一滴到铜网上,室温干燥,然后用TEM观察F1的构象。

1.2.7 F1的免疫增强活性 采用断颈法处死BALB/C小鼠,在75%的酒精中浸泡3 min消毒。取出转入超净工作台的解剖盘中,逐层剪开腹腔,无菌操作取出脾脏,去除周围的脂肪组织,并用PBS缓冲液淋洗,转入盛有预冷的RPMI1640培养液的平皿中。用无菌注射器反复注射RPMI1640培养液到脾脏中冲出脾细胞,然后将脾细胞剪碎,无菌注射器芯研磨并过细胞筛网(40 μm),将脾细胞悬液收集到离心管中,室温,2000 r/min离心10 min,去上清,加入红细胞裂解液,5 min后离心去除红细胞,用预冷的PBS洗涤2次,最后重悬于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液,即得脾细胞悬液,采用台盼蓝染色计数,调整细胞浓度为1×106cells/mL。

用脾细胞悬液铺96孔板,每孔加入上述调整好浓度的脾淋巴细胞200 μL和50 μL 不同浓度的F1母液样品,使得F1的终浓度分别为2、4、8、32、128 μg/mL,脂多糖(LPS,终浓度为5 μg/mL)作为阳性对照,添加完全RPMI1640培养基作为阴性对照。每组设置5个复孔,置于二氧化碳培养箱中,37 ℃,培养44 h。培养结束后,按照CellTiter 96 Aqueous One Solution试剂盒的说明加入MTS溶液,再将96孔板放入二氧化碳培养箱孵育6 h,然后用酶标仪测定各孔在490 nm的吸光度值。

1.2.8 数据分析 采用单因素方差分析和Student’s t检验,以p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 BD3526无氮培养基胞外多糖的制备及分离纯化

BD3526是本实验室从西藏牦牛奶中分离得到的一株菌,经鉴定其为类芽孢杆菌属的一个新种[9]。在实验过程中,发现BD3526在无氮培养基平板上分泌非常粘稠的物质,极有可能是分子量很高的胞外多糖,因此,刮取平板上的菌落,按照提取胞外多糖的方法制备得到粗品。对此胞外多糖粗品用终浓度5%三氯乙酸去蛋白,透析72 h、冻干,冻干后的样品用DEAE-Sepharose FF进行分离纯化,结果如图1所示,F1、F2和F3均是中性多糖,在NaCl梯度洗脱部分没有检测到多糖组分(数据未列出),这与BD3526在TYC(胰蛋白胨酵母粉胱氨酸培养基)中产的胞外多糖的组成有所不同,其在TYC培养基中产的胞外多糖含有一个中性多糖左聚糖和两个带阴离子电荷的多糖组分,这种差异可能与培养基成分不同有关。F1是BD3526在无氮培养基平板上产的胞外多糖中的主要成分,含量为96.8%,F2和F3的含量极少,几乎得不到纯品,因此,本文重点研究F1的理化性质和生理功能;Bradford法[26]检测结果表明,F1样品中不含有蛋白质。

图1 BD3526在无氮培养基上产的胞外多糖(NEP)的DEAE-Sepharose FF柱洗脱曲线Fig.1 DEAE-Sepharose FF chromatographic profile of exopolysaccharides produced by BD3526 in medium without nitrogen source

2.2 F1的分子量及分布测定

采用马尔文多检测器GPC测定F1样品的纯度和分子量及分布,结果如图2和表1所示。图2中F1的RI图谱和静态光散射图谱中都只有一个尖锐且对称的峰,表明F1是纯度很高的单一多糖组分;由表1可知F1的分子量非常大,其重均分子量(Mw)为3.76×107Da,但分子量分布却非常窄,只有1.012,这比商业化的多糖标样右旋糖酐的分子量分布(1.370)都窄,可以开发其为多糖的标样。F1的分子量大于BD3526在产糖培养基中产的主要多糖组分左聚糖的分子量,根据静态光散射信号计算得出F1的均方回转半径(Rg)是43.4 nm,而BD3526在产糖培养基中产的主要多糖组分左聚糖因其Rg太小而无法计算出具体的数值[10]。BD3526产的胞外多糖的分子量之间的巨大差异可能与培养其的方式有很大关系,即是固体培养还是液体培养。

图2 F1的GPC洗脱曲线Fig.2 The GPC profile of F1注:浓度为1 mg/mL,RLS为直角静态光散射检测器信号,LLS为小角静态光散射检测器信号,RI为示差检测器信号。

样品Mw(Da)Mw/MnRg(nm)F13.76×1071.01243.4

2.3 F1的结构表征

首先,采用KBr压片法对F1进行红外光谱分析。如图3所示,3442 cm-1处的峰是F1的O-H键的伸缩振动峰,表明F1分子内存在很强的氢键;2932和2883 cm-1处是C-H的伸缩振动峰,为糖类的特征峰;而1128～1000 cm-1之间存在的峰对应多糖C-O-C和C-O-H的伸缩振动峰,同时,在1100和1010 cm-1之间只有两个吸收峰,说明F1主要是呋喃糖组成的;在927 cm-1处尖锐的吸收峰是由果糖基的呋喃环的伸缩振动引起的[27],809 cm-1处的吸收峰也是果聚糖的特征吸收峰[28];因此,F1很有可能也是左聚糖。

图3 F1的FT-IR谱图Fig.3 The FT-IR spectrum of F1

采用1H NMR继续表征F1的结构,如图4所示,F1的氢谱与BD3526在TYC培养基中产的胞外多糖的主要成分左聚糖的谱图完全相同[10],且图谱中异头氢区域没有任何信号,表明F1是分子量超大的直链左聚糖。

图4 F1的1H NMR谱图Fig.4 1H NMR spectrum of F1

2.4 F1的热分析

热重分析可以提供F1的水分含量和热稳定性。在测试前,将F1在真空干燥箱(50 ℃)干燥24 h。在氮气氛围中加热,F1经历了几个阶段的热降解,如图5所示。在加热到165 ℃左右时,F1大约失去了4.2%的重量,这可能归因于残留的水分和F1的初步分解;F1开始发生分解的温度约是165 ℃,而文献报道一株Bacillussp.产的左聚糖的起始分解温度是213.7 ℃[29],HalomonassmyrnensisAAD6T产的左聚糖的起始分解温度是227 ℃[30],F1的分子量虽然高于上述两株菌产的左聚糖的分子量,但其起始分解温度却比这两株菌产的左聚糖的起始降解温度降低了约50 ℃左右,这可能是由于三者的化学结构不完全相同;在165～210 ℃,F1样品的质量显著地降低,这一阶段样品的质量损失率是最大的;在210～300 ℃时,F1的质量继续减少(10%～15%),但是质量损失率越来越小;在温度为300～890 ℃时,F1进入了最后的分解阶段。因此,在150 ℃以下,F1具有良好的热稳定性。

图5 F1的热重和差示扫描量热法分析曲线Fig.5 The TG and DSC curves of F1

真空干燥后的F1样品经历了升温-冷却-升温的热循环,对其进行差示扫描量热法分析。首次升温扫描阶段(图谱未列出),F1在110～125 ℃温度上升期间出现了斜率变化,而在后续的冷却和再升温阶段却没有再出现这样的特征,这可能是由于F1中残留的结合水在第一次升温时蒸发完全所致。F1的第一次冷却扫描(图谱未列出)和第二次升温扫描(图5所示)显示出可重复的相同的热转换阶段,由此确定F1的玻璃化转变温度约为42.3 ℃;F1的玻璃化转变温度显著低于Chen等[29]报道的一株Bacillussp.产的左聚糖的玻璃化转变温度(75.5 ℃),这个差异与多种因素相关,如二者的分子量、分子结构以及结合水的含量。

2.5 F1在水溶液中的构象

F1溶于超纯水中,浓度达到2.5 mg/mL时,其溶液呈现淡蓝色,这可能是因为F1分子量巨大,在溶液中形成了具有一定粒径大小的颗粒,导致其水溶液具有了胶体溶液的特征,因此,本文采用动态光散射仪测定水溶液中F1聚集体的粒径大小,结果如图6所示。由图6可知,F1在水溶液中大部分是以聚集体形颗粒存在,粒径大约163.2 nm,小部分F1以单分子状态存在,其单分子大小只有3.40 nm左右。

图6 F1在超纯水溶液(浓度:2.5 mg/mL)物乳杆菌混合发酵正交实验因素水中的流体力学半径(Rh)分布Fig.6 Distribution of the hydrodynamic radius Rh for F1 in ultrapure water at concentration of 2.5 mg/mL

图7是F1的TEM照片,表明F1聚集体颗粒的粒径在50～100 nm范围内;TEM给出的纳米粒的粒径一般都小于DLS测定的数值,这是由于DLS测定的是粒子的水合半径而TEM测定的是粒子干燥后的大小。相同浓度下,F1聚集体的粒径大于BD3526在产糖培养基中产的左聚糖聚集体的粒径[10],这可能是由于二者分子量大小不同所致。

图7 F1的TEM图谱(2.5 mg/mL)Fig.7 The TEM image of F1(2.5 mg/mL)

2.6 F1的免疫增强活性研究

大部分微生物的胞外多糖都能够增强细胞介导的免疫反应,如促进T/B淋巴细胞增殖、单核细胞吞噬能力等。脾脏淋巴细胞中包括T淋巴细胞和B淋巴细胞,两者含量基本相近;T和B淋巴细胞是两类重要的免疫激活细胞,多糖的免疫调节作用是从激活淋巴细胞和巨噬细胞开始的。最近,有文献报道Bacilluslicheniformis8-37-0-1产的左聚糖能显著促进脾细胞的增殖[31],而BD3526在产糖培养基中产的左聚糖在浓度大于128 μg/mL时可显著促进脾细胞的增殖[10]。BD3526在无氮培养基平板上产的多糖虽然也是左聚糖,但其分子量远大于其在产糖培养基中产的左聚糖的分子量,因此,本文考察此超大分子量左聚糖对脾淋巴细胞增殖的影响,实验结果如图8所示。

由图8可知,F1促进脾细胞增殖具有浓度依赖性,当浓度大于8 μg/mL时,F1即可显著刺激脾细胞增殖,且当浓度为128 μg/mL时,其促进脾细胞增殖的作用略强于阳性对照LPS;F1促进脾淋巴细胞增殖作用远强于BD3526在产糖培养基中产的左聚糖的效果,这说明BD3526产的直链左聚糖,分子量越大,促进脾细胞增殖的作用越强。

图8 F1对脾淋巴细胞增殖的影响Fig.8 The effect of F1 on the proliferation on BALB/C mouse spleen cells in vitro注:*代表差异显著(p<0.05)。

3 结论

BD3526是类芽孢杆菌属的一个新种,其在无氮固体培养基上产的胞外多糖主要是分子量超大的左聚糖(96.8%,w/w),其重均分子量为3.76×107Da,分子量分布只有1.012;此左聚糖的均方回转半径是43.4 nm,其在水溶液中形成的聚集体的水合半径是163.2 nm,TEM结果表明其粒径在50～100 nm范围;此左聚糖的玻璃化转变温度是42.3 ℃,温度低于150 ℃时其具有良好的热稳定性,温度继续升高,此左聚糖即开始迅速分解;此左聚糖在低浓度时(8 μg/mL)即可显著促进脾细胞增殖,在高浓度时,其促进脾细胞增殖的作用略强于LPS;与BD3526在产糖培养基中产的左聚糖相比,其在无氮固体培养基上产的左聚糖的免疫调节活性更强。本研究为BD3526产的左聚糖作为功能性成分应用于食品行业提供了数据支持,也为将BD3526开发为食品新资源提供一定的理论基础。

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StudyontheexopolysaccharidesproducedbyPaenibacillusbovissp.novBD3526innitrogen-freesolidculturemedium

XUXiao-fen

(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology,Dairy Research Institute,Bright Dairy & Foods Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China)

This study was aimed to investigate the structure and bioactivities of exopolysaccharides produced byPaenibacillusbovissp. nov BD3526 in nitrogen-free solid culture medium. The exopolysaccharides were prepared,and then separated and purified by DEAE-sepharose fast flow and one main component was obtained(F1). Its molecular weight and molecular weight distribution was determined by gel permeation chromatography while its chemical structure was characterized by FT-IR and1H NMR,indicating F1 was linear levan with ultrahigh molecular weight of 3.76×107Da. It had good thermal stability,which was analyzed by thermogravimetric analysis(TGA)and differential scanning calorimetry(DSC). DLS result indicated the particle size of its aggregates in aqueous solution was 163.2 nm while its conformation was characterized as compact sphere(50～100 nm)by TEM. Finally,its immunological activity was evaluated by aninvitromethod and the result demonstrated F1 could significantly stimulate the proliferation of spleen cells,indicating it can be a potential natural immunomodulator. This levan could be an immunoenhancer to be used in functional food field.

exopolysaccharides;levan;thermal analysis;immunostimulatory activity

2017-02-13

徐晓芬(1986-)，女，博士，工程师，研究方向：乳酸菌发酵产物的生物活性，E-mail：rachelxu809@163.com。

国家“十二五”科技支撑计划课题(2013BAD18B01)；上海市科委工程技术研究中心能力提升项目(16DZ2280600)；上海市闵行区领军人才项目(201443)。

TS252.1

:A

:1002-0306(2017)16-0095-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.019