(1.晋中学院,山西榆次 030619;2.中国热带农业科学院椰子研究所,海南文昌 571339)

椰子谷蛋白-1功能特性的分析

郭帅1,2

(1.晋中学院,山西榆次 030619;2.中国热带农业科学院椰子研究所,海南文昌 571339)

本实验采用分步提取和膜分离结合的方法从椰肉中提取椰子谷蛋白-1,测定其氨基酸组成,利用SDS-PAGE和柱层析技术分析其分子量分布和亚基组成,利用DSC技术分析其耐热性,然后对谷蛋白-1的乳化性和起泡性进行了分析。结果表明:椰子谷蛋白-1中含有16种氨基酸,天冬氨酸和精氨酸的含量很高,SDS-PAGE表明,椰子谷蛋白-1含有5个亚基,分子量分布在19.6～50.6 kDa 之间。DSC扫描结果表明,椰子谷蛋白-1具有较好的热稳定性。功能特性实验表明,椰子谷蛋白-1有良好的乳化稳定性(85.17%±1.41%)和泡沫稳定性(89.15%±5.75%),均优于大豆分离蛋白。该结果表明椰子谷蛋白-1具有开发为乳化稳定剂和泡沫稳定剂的潜力。

椰子谷蛋白-1,分离,理化性质,功能特性

依据溶解性,蛋白质可分为清蛋白(albumin,溶于水)、球蛋白(globulin,溶于稀盐溶液)、醇溶蛋白(prolamines,溶于70%～90%的醇水溶液)、谷蛋白-1(glutelin-1,溶于稀酸)和谷蛋白-2(glutelin-2,溶于稀碱溶液)[1]。植物贮藏蛋白往往都含有这几种蛋白质,各溶解度蛋白的含量和比例既决定了天然蛋白的营养价值,又影响其功能特性。大多数植物蛋白质的等电点多在pH3.0～5.0,即在酸性环境下,大多数植物蛋白溶液的静电荷为零,溶解度最低,乳化性和起泡性较差,影响了其在食品工业尤其是酸性食品中的应用。而谷蛋白-1的等电点较高,能够很好地溶解于稀酸溶液中,在食品工业尤其是酸性食品中有潜在的用途。近年来,植物谷蛋白-1的开发受到广泛关注。研究表明,椰子蛋白中清蛋白占21%、球蛋白占40.1%、醇溶蛋白占3.3%,谷蛋白-2占4.8%,而谷蛋白-1占14.4%[2]。椰麸是椰肉榨汁后的副产物,含有8%～16%的蛋白质,是丰富的植物蛋白质资源。然而,目前椰麸仅仅被用作动物饲料或蛋糕等食品的辅料,蛋白质等活性成分没有被开发利用,造成了资源的极大浪费。而目前的研究多集中于椰子油[3]、椰子分离蛋白[4-8]、椰子贮藏蛋白[9-11]等方面,对椰子清蛋白、球蛋白、谷蛋白等组分蛋白的研究较少,这对于我国椰子加工业的发展十分不利。因此,本实验以椰麸为原料制备椰子谷蛋白-1(coconut glutelin-1,CG-1),分析其氨基酸组成、分子量分布、亚基构成等理化性质,同时研究其乳化性、起泡性、黏度等功能特性,试图为椰子蛋白的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

椰麸 由南椰食品科技有限公司提供;大豆分离蛋白(SPI) 上海生物科技有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醚、无水乙醇、冰乙酸、考马斯亮蓝G-250、样品缓冲液、脱色液等 均为分析纯;低分子量标准蛋白(14.4～97.4 kDa)、SDS(十二烷基磺酸钠)、丙烯酰胺等 Sigma公司。

JB-3型磁力搅拌器 金坛市金城硕华仪器厂;7230G型分光光度计 上海申光科学仪器公司;D-78532型台式高速冷冻离心机 德国Hettich公司;Thermal-20型真空冷冻干燥器 美国Thermal公司;HITACHI L-8900型氨基酸自动分析仪 日本HITACHI公司;DSC1-差式扫描量热仪 梅特勒-托利多公司;XHF-D型分散仪 宁波科技有限公司;DYCZ-24D型电泳槽、DYY-6C型电泳仪 北京六一厂;Synene BOXF3型凝胶分析仪 日本Gene公司;RVA-Tecmaster型黏度仪 上海精密仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1 脱脂椰麸的制备 椰麸→鼓风干燥箱中干燥(50 ℃、4 h)→粉碎→过60目筛→加入石油醚(料液比为1∶10)→室温下振荡脱脂2 h→过滤→弃滤液→重复脱脂3～4次→脱脂椰麸。

1.2.2 椰子谷蛋白-1(CG-1)的制备 参照Hu和Esen[12]的方法,100 g脱脂椰麸中加入500 mL、0.4 mol/L NaCl,4 ℃下搅拌提取8 h,过滤,收集滤渣,再次加入0.4 mol/L NaCl,如此重复提取3次,弃去滤液,以除去椰子球蛋白。收集滤渣,加入0.1 mol/L HCl,4 ℃、搅拌提取8 h,重复提取3次,合并提取液。然后在4 ℃、10000×g下离心30 min,收集上清液,装入截留分子量为4000 Da的透析膜中,4 ℃下、在dH2O中透析24 h,每隔2 h换一次水,将透析液真空冷冻干燥(-40 ℃、-0.1 MPa)后即得到CG-1。

1.2.3 椰子分离蛋白(coconut protein isolate,CPI)的提取 将脱脂椰麸分别与pH7.8的磷酸盐缓冲液、pH6.8的Tris-HCl缓冲液和pH8.0的硼酸按料液比1∶20混合,4 ℃水浴中磁力搅拌提取8 h后,6000 r/min下,离心15 min,收集上清液→膜透析(半透膜截留分子量为4 kDa)→调节上清液pH至3.5～4.5,静置0.5 h→再次磁力搅拌15 min,在6000 r/min下,离心15 min→收集沉淀→洗涤3～4次→-40 ℃下真空冷冻干燥(-40 ℃、-0.1 MPa)→CPI[7]。

1.2.4 氨基酸组成分析 称取0.1 g椰子谷蛋白-1,加入5 mL、6 mol/L的盐酸中,110 ℃下水解24 h。用0.45 μm的膜过滤水解液,收集滤液,在HITACHI L-8900型氨基酸自动分析仪上测定。

1.2.5 差示扫描量热法(DSC)分析 称取10 mg CG-1或CPI于样品盘中,加入15 μL蒸馏水,在DSC1型扫描仪中扫描。温度范围为30～130 ℃,升温速度为10 ℃/min。取一空白样品盘加盖作为对照。

1.2.6 SDS-PAGE凝胶电泳分析 参照文献[13]中的方法进行。将蛋白质溶液浓度调节至1 mg/mL,与样品缓冲液按1∶1的比例混合,100 ℃煮沸5 min,上样15 μL,恒压电泳(浓缩胶100 V,分离胶150 V),当溴酚蓝指示剂距胶底部5 mm时,停止电泳,剥下胶片后,将胶片放入固定液中固定30 min,然后考马斯亮蓝R-250染色,过夜,放入脱色液中脱色,直至胶片背景蓝色完全透明状。

1.2.7 乳化性和乳化稳定性的测定 采用浊度法[15]。取磷酸缓冲溶液(pH=7.0)30 mL,加入0.1 g CG-1(或CPI),混匀,在高速匀浆机中以10000 r/min匀浆30 s后立即于溶液底部吸取50 μL乳浊液加到15 mL、0.1% SDS中,于500 nm处测其吸光值AO,此值即为。静置10 min后,重新测定吸光值At。乳化活性(emulsifying activity index,EAI)表示为:

EAI=(2.303×2×Ao×dilution factor)/(C×Ф×10000)

式(2)

其中,dilution factor为稀释倍数,C-蛋白质浓度,Ф-油相在乳化液中的体积比例(0.25)。

乳化稳定性(emulsifying stability,ES)则为:

ES=(AO×T)/(AO-At)

式(3)

其中,T=10 min。

以SPI做对照,实验均重复3次,取平均值。

1.2.8 起泡性与泡沫稳定性的测定 参考文献[16]中方法进行,略有改动,将0.1 g CG-1(或CPI)溶解到100 mL dH2O中,在高速分散器中以10000 r/min搅拌1 min,记录匀浆停止时泡沫的体积V0,以SPI做对照,起泡性(foaming capacity,FC)计算公式如下:

FC(%)=V0/100 mL×100

式(4)

放置30 min后,记录剩余泡沫的体积(Ve),泡沫稳定性(foam stability,FS)的计算公式如下:

FS(%)=Ve/V0×100

式(5)

1.2.9 黏度的测定 黏度(Visocosity)的测定参照Tsumura等人[17]的方法,在RVA-Tecmaster型黏度仪上测定,以SPI做对照。

1.3数据处理

实验均重复3次,取平均值。采用DPS v755软件进行,多重比较采用邓肯氏新复极差法进行。

2 结果与分析

2.1氨基酸组成

CG-1和CPI的氨基酸组成与含量如表1所示。

从表1可以看出,CG-1和CPI的氨基酸组成类似,都含有16种氨基酸,其精氨酸和谷氨酸含量都较高。8种必需氨基酸中,甲硫氨基酸的含量较低;但CG-1和CPI中亮氨酸、异亮氨酸和苏氨酸的含量以及必需氨基酸总和(TEAA)均显著高于FAO/WHO[18]的推荐值(12.7 g/100 g蛋白质),表明CG-1和CPI的氨基酸组成相对合理。

表1 椰子谷蛋白-1和椰子分离蛋白的氨基酸组成和含量(g/100 g蛋白质)Table 1 Composition and content of amino acid in CG-1 and CPI(g/100 g protein)

注:同行的数值上标注的不同小写字母表示显著性差异(p<0.05);cTEAA,必需氨基酸总和;ND,表示未检出。2.2 DSC分析

CPI和CG-1的DSC分析结果如图1所示。

如图1所示,在30～130 ℃内,随着温度的升高,CPI和CG-1的焓值变化相对平稳,未出现明显的放热峰或吸热峰,即没有发生化学键的断裂,表明这两种椰子蛋白的热稳定性较好。

图1 椰子分离蛋白和椰子谷蛋白-1的DSC分析Fig.1 DSC analysis of CPI and CG-1

2.3 SDS-PAGE分析

用5%浓缩胶、12%分离胶的SDS-PAGE凝胶电泳系统分析CG-1和CPI的分子量分布和亚基构成,结果如图2所示。

图2 椰子分离蛋白和椰子谷蛋白-1的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analyses of CPI and CG-1注:各图最左侧每一条蓝色条带都表示一个蛋白质亚基。

图2中结果表明,在分子量分布和亚基构成方面,CG-1和CPI之间的差异较大。CG-1主要由6个亚基组成,分子量范围为19.6～50.6 kDa,其中分子量小于33.4 kDa的亚基的含量较高;CPI主要由7条亚基构成,分子量范围为18.7～51.8 kDa,其中分子量为51.8和50.6 kDa的亚基的含量较高。CPI中亚基组成和分子量的结果与前人的报道一致[8,11]。亚基构成和分子量大小对蛋白质的理化性质和功能特性有较大的影响。

2.4乳化性分析

不同离子强度下,CG-1和CPI的乳化性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性和黏度如表2所示。

如表2所示,三种蛋白质中,CG-1的乳化性显著低于CPI和SPI(p<0.05),而CPI的乳化性最高。然而,CG-1和CPI的乳化稳定性显著高于SPI(p<0.05)。同时,离子强度为0～0.4 mol/L时,随着离子强度的升高,CG-1、SPI和CPI的乳化性都升高;但当离子强度增大到0.6 mol/L时,SPI和CPI的乳化性反而下降。其原因可能是低离子强度可以提高蛋白质的溶解度,增强乳化液中蛋白质-水-油的相互作用从而提高乳化性;而高离子强度则使蛋白质的溶解度下降,称为“盐析”,减弱了乳化液中蛋白质-水-油的相互作用,使乳化性降低。乳化性和乳化稳定性是蛋白质的重要性质,决定其在食品工业中的用途。本实验结果表明,CG-1和CPI具有较好的乳化稳定性。本实验中,CG-1的乳化性虽然很差,但它的乳化稳定性较好,显著优于大豆分离蛋白,因此说其具有开发为乳化稳定剂的潜力。

表2 椰子分离蛋白和谷蛋白-1在不同离子强度下的功能特性Table 2 Functional properties of the coconut cake protein fractions at different ion strength

注:同列中不同字母表示显著性差异(p<0.05)。

2.5起泡性分析

表2中结果显示,CG-1和CPI的起泡性都显著低于SPI,但泡沫稳定性却均显著高于SPI(p<0.05)。蛋白质起泡性是蛋白质-空气-水的作用的表现,决定蛋白质起泡性的因素有蛋白质的溶解度、分子大小、表面疏水性等。CG-1为酸溶性谷蛋白,在中性的水溶液中溶解度较低,这可能是其较差起泡性的原因之一。同时,表1中结果显示CG-1和CPI中,精氨酸和谷氨酸等极性氨基酸的含量很高,导致其表面疏水性较低,最终表现出较低的起泡性。Zheng等人[19]的研究表明,蛋白质的起泡性是由溶解性和表面疏水性共同决定的。蛋白质的泡沫稳定性除了与溶解性和表面疏水性有关外,还与其分子量大小有关。前人的研究结果也表明,较低的起泡性往往意味着较高的泡沫稳定性[20]。

随着离子强度的升高,CG-1、CPI和SPI的起泡性都降低。这可能是因为,大量盐离子的加入,改变了蛋白质表面的电荷数量和性质,同时破坏了蛋白质表面的水膜,提高了蛋白质在空气-水界面的表面张力,使CG-1等蛋白质的起泡性下降。起泡性和泡沫稳定性也是决定蛋白质在食品工业中用途的重要性质,本实验结果表明,CG-1和CPI的起泡性较差,但泡沫稳定性很好,可以开发为泡沫稳定剂。

2.6黏度

具有较高黏度的蛋白质可作为质构改善剂、增稠剂等应用于火腿肠、肉汤等食品中。决定黏度的因素主要是蛋白质-蛋白质、蛋白质-水之间的作用。表2中结果表明,相同离子强度下,CG-1和CPI的黏度低于SPI,但高于葵花籽蛋白和花生蛋白[21]。同时,离子强度的增大有助于CG-1和CPI黏度的升高。SPI是较好的增稠剂,已广泛应用于食品工业中。本实验结果表明,CG-1和CPI的黏度略低于SPI,也可作为增稠剂应用于食品工业中。

3 结论

本实验结果表明,CG-1含有16种氨基酸,必需氨基酸组成较为合理;CG-1主要含6条亚基,分子量范围为19.6～50.6 kDa,其中分子量小于33.4 kDa的亚基的含量较高。DSC结果表明CG-1在30～130 ℃下的热稳定性较好。与大豆分离蛋白相比,CG-1的乳化性、起泡性和黏度较差,但其乳化稳定性和泡沫稳定性均优于大豆分离蛋白。这些结果表明,CG-1可以作为乳化稳定剂和泡沫稳定剂等应用于食品工业中。

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Analysisonfunctionalpropertiesofcoconutglutelin-1

GUOShuai1,2

(1.College of Jinzhong,Yuci 030619,China;2.Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences,Wenchang 571339,China)

The glutelin-1 was extracted from coconut with step by step method assisted with membrane purification technology. Then the amino acid composition,distribution of molecular weight and subunits,thermal property,emulsifying and foaming properties of coconut glutelin1 were studied. Results showed that the glutlelin-1 contained 16 kind of amino acid,with the feature of a large amount of glutamic acid and arginine. There were five subunits with molecular weight 19.6 to 50.6 kDa in coconut glutelin-1. Moreover,coconut gultelin-1 exhibited good emulsion stability(85.17%±1.41%)and foaming capacity and stability(89.15%±5.75%),which was all higher than that of soybean protein isolate. This meant that coconut gultelin-1 had potential usage in food industry as emulsion stabilizer and foam stabilizer.

coconut glutelin-1;purification;characterization;functional properties

2017-02-07

郭帅(1981-),男,硕士,讲师,研究方向:食品科学与工程,E-mail:jzxygs@yeah.net。

海南省重点研发计划(ZDZX2017061)。

TS201.2

:A

:1002-0306(2017)16-0075-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.015