显齿蛇葡萄种皮中花色苷及多糖体外抗氧化活性评价

2017-09-18,,,,,

食品工业科技 2017年16期

关键词：种皮花色自由基

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(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳 550001)

显齿蛇葡萄种皮中花色苷及多糖体外抗氧化活性评价

杨丽丽,石治敏,焦思棋,吴少锦,邹荣灿,余正文*

(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳 550001)

显齿蛇葡萄种皮,花色苷,多糖,抗氧化活性

显齿蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W. T. Wang]为葡萄科显齿蛇葡萄属植物[1],具有清热解毒、祛风湿、强筋骨等功效[2]。显齿蛇葡萄嫩叶经杀青、揉捻、烘干而成的类茶饮料藤茶,具有消炎、镇疼、止咳、祛痰、降血压、降脂、抗肿瘤和保肝护肝的功效[3]。花色苷是广泛存在于自然界中的一种植物色素,作为天然食用色素,无毒、无害,资源丰富,具有一定的营养价值和药理作用,在食品、化妆品、医药领域都有巨大的应用价值[4]。多糖分布于自然界高等植物、藻类、微生物与动物体内,是生物有机体的重要组成成分,具有抗氧化[5-6]、抗病毒[7-8]、抗肿瘤[9]以及免疫调节活性。

目前,所用的抗氧化剂大多为人工合成,对人体具有潜在的危害[10]。天然抗氧化剂来源于植物,无毒无害,安全可靠。花色苷、多糖具有抗炎,增强免疫活性,抗衰老等作用[11-12],可作为天然抗氧化剂。国内外主要集中于对显齿蛇葡萄叶花色苷、多糖的提取分离、稳定性分析及生物活性等方面的研究[13-14],对种皮的研究鲜有报道。本文测定显齿蛇葡萄种皮中花色苷、多糖的含量,并测定其体外抗氧化活性,为显齿蛇葡萄种皮后续综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

显齿蛇葡萄种皮 1号为原产地母株果实(贵州省贞丰县挽澜乡窑上村,海拔:1299 m),2～4号均为母株扦插后栽培1年的子株果实(贵州省兴仁县新龙场镇大屯村科研基地,海拔:1434 m),-18 ℃保存备用;维生素C 青岛贺阳化玻有限公司;硫酸亚铁济宁宏明化学试剂有限公司;30%的双氧水溶液天津市东丽区华明街北于堡工业小区;水杨酸成都联禾化工医药有限责任公司;EDTA 重庆化学试剂总厂;三羟甲基氨基甲烷南京化学试剂总厂;盐酸广西浙创化工有限公司;连苯三酚湖南洪江棓雅生物科技有限公司;DPPH 合肥博美生物科技有限公司;葡萄糖天津市鲁鑫化工科技有限公司；以上试剂均为分析纯。

KQ-500DE型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;分析天平(十万分之一) 梅特勒一托利多仪器有限公司;超纯水系统 LAB-BIOGEN倍捷科技;电子恒温不锈钢水浴锅上海宜昌仪器纱筛厂;EYELA N1001旋转蒸发仪 BIOGEN倍捷科技;UV759CRT紫外可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 显齿蛇葡萄种皮花色苷、多糖的提取显齿蛇葡萄种皮分别为1号、2号、3号、4号共四个样品。

1.2.1.1 花色苷的提取分别称取显齿蛇葡萄种皮样品15.0000 g,加入150 mL提取剂(V乙醇∶V盐酸∶V水=60∶1∶39),于35 ℃下浸提2 h,抽滤,减压浓缩得浸膏[15],50 mL容量瓶定容,待用。

1.2.1.2 多糖的提取分别称取显齿蛇葡萄种皮样品15.0000 g,加适量石油醚加热提取2 h,抽滤得脱脂种皮。按1∶10的料液比加蒸馏水,功率250 W超声提取30 min,重复超声提取3次,合并滤液,减压浓缩得浸膏[16],50 mL容量瓶定容,待用。

1.2.2 花色苷含量测定采用pH示差法[17]测定花色苷含量。分别用KCl-HCl缓冲液(0.025 mol/L,pH=1.0)和乙酸钠-HCl缓冲液(0.4 mol/L,pH=4.5)稀释至适当倍数(使pH=1.0时的吸光度在0.2～0.7之间),放置 15 min后,于波长520 nm处测定吸光度。计算公式如下:

花色苷含量(mg/100 g)

式中:449.29是矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔质量(g/mol);DF是稀释倍数;V是提取溶剂的体积(mL);26900是矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数(L·mol/cm);m是显齿蛇葡萄的质量(g);1是比色皿的光路长度(cm)。

1.2.3 多糖含量的测定

1.2.3.1 多糖标准曲线绘制采用紫外可见光分光光度法测定多糖含量。精密吸取0.2031 mg/mL葡萄糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL分置于具塞试管中,加蒸馏水至体积为2.0 mL,再加5%的苯酚1.0 mL,迅速摇匀后滴加浓硫酸5.0 mL,置沸水浴中加热15 min,取出冷却至室温。于490 nm处测吸光度,绘制葡萄糖标准曲线。实验得标准回归曲线方程:A=12602c+0.0459,R2=0.9998。式中:A为多糖的吸光度;c为多糖浓度,mg/mL。

1.2.3.2 多糖含量测定精密量取多糖提取液,稀释至实验所需浓度(0.01、0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/g),按照1.2.3.1方法测定。

1.2.4 羟自由基清除能力的测定参照文献[18],向试管中依次加入2.0 mL、6 mmol/L硫酸亚铁溶液、2.0 mL不同浓度(0.01、0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/g)的花色苷、多糖或 VC溶液,2.0 mL、6 mmol/L双氧水溶液,混匀,静置10 min。再2.0 mL、6 mmol/L水杨酸溶液,混匀,静置30 min,测定其在510 nm 处的吸光值A样品;以蒸馏水取代水杨酸溶液,测定A对照;以蒸馏水取代花色苷、多糖溶液或 VC溶液,测定A空白。

1.2.6 DPPH自由基清除能力的测定参照文献[20],取2.0 mL、不同浓度(0.01、0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/g)花色苷、多糖或VC溶液分别与2.0 mL的 DPPH·乙醇溶液(0.2000 mmol/L)、蒸馏水混合均匀,室温避光静置1 h,测定其在517 nm处的吸光值A样品和A空白;再将2.0 mL DPPH·乙醇溶液与等体积蒸馏水混匀,以相同方法测定A对照。

1.3数据处理

实验数据分别由Excel,Origin 9.0和SPSS软件处理。

2 结果与讨论

2.1花色苷、多糖含量

经测定1号、2号、3号、4号四个样品的花色苷含量分别为0.79、1.05、1.35、1.02 mg/g;多糖含量分别为106.3、101.5、91.2、99.9 mg/g。研究表明,一般随海拔高度的增加,紫外线加强,果实着色度和着色率明显提高[21]。而多糖的代谢积累与海拔高度关系要复杂些,如人参多糖的量随海拔的升高而增加(100～800 m);人参多糖的量随海拔的升高而减少(1200～1450 m)[22]。本研究的海拔高度内(1200～1450 m),花色苷含量随海拔高度的增加而增加;多糖的含量随海拔高度的增加而减小。

2.2羟自由基清除能力

显齿蛇葡萄花色苷、多糖提取物对·OH的清除能力见图1、图2。

图1 花色苷对羟自由基清除能力Fig.1 Scavenging activity of anthocyanins to hydroxy radical

图2 多糖对羟自由基清除能力 Fig.2 Scavenging activity of polysaccharides to hydroxy radical

从图1、图2可以看出:在实验浓度范围内,显齿蛇葡萄花色苷、多糖提取物对·OH均有清除能力,且随着浓度的增加,清除率也随之增加,都低于VC。且花色苷、多糖含量越高,·OH清除能力越强。

2.3超氧阴离子自由基清除能力

图3 花色苷对超氧阴离子自由基清除能力 Fig.3 Scavenging activity of anthocyanins to superoxide

图4 多糖对超氧阴离子自由基清除能力Fig.4 Scavenging activity of polysaccharides to superoxide

2.4 DPPH自由基清除能力

显齿蛇葡萄花色苷、多糖提取物对DPPH·的清除能力见图5、图6。

图5 花色苷对DPPH自由基清除能力Fig.5 Scavenging activity of anthocyanins to DPPH radical

图6 多糖对DPPH自由基清除能力Fig.6 Scavenging activity of polysaccharides to DPPH radical

从图5、图6可以看出，在实验浓度范围内,显齿蛇葡萄花色苷、多糖提取物对DPPH·均有清除能力,且随着浓度的增加,清除率也随之增加,均高于VC。当浓度为0.5 mg/mL时,清除率均高于80%;且花色苷、多糖的含量越高,DPPH·的清除能力越强。

2.5花色苷、多糖含量及各模型的IC50值

表1 花色苷、多糖含量及各模型的IC50值Table 1 Contents of anthocyanins and polysaccharides and value of IC50 of each model

2.6花色苷、多糖含量与IC50值的相关性分析

花色苷含量与羟基自由基的IC50值和超氧阴离子自由基的IC50值在0.05水平上显著相关,与DPPH自由基的IC50值在0.01水平上显著相关;多糖含量与羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的IC50值相关性不显著。

表2 花色苷、多糖含量与IC50值相关性(Pearson系数)Table 2 Correlation of the content of anthocyanin and polysaccharide and IC50value(coefficient of pearson)

注:**表示在0.01水平(双侧)上显著相关;*表示在0.05水平(双侧)上显著相关。

3 结论

本研究首次测定显齿蛇葡萄种皮中花色苷、多糖含量,对花色苷、多糖进行清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基能力测定,并与VC对照来评价花色苷、多糖的体外抗氧化能力。当花色苷、多糖的浓度在0.01～2.00 mg/mL范围时,其清除自由基能力与浓度存在量效关系;花色苷与DPPH自由基清除活性之间呈极显著负相关(p<0.01);显齿蛇葡萄种皮花色苷、多糖对DPPH自由基的清除能力优于VC,显示出较好的抗氧化活性,可用于开发天然抗氧化剂。

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EvaluationofantioxidantactivityinvitroofanthocyaninsandpolysaccharidesintheseedcoatofAmpelopsisgrossedentata

YANGLi-li,SHIZhi-min,JIAOSi-qi,WUShao-jin,ZOURong-can,YUZheng-wen*

(School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)