,，2,,2,*,,2,,2,,2

(1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;2.广东省水产品加工与安全重点实验室,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,国家贝类加工技术研发分中心(湛江),南海生物资源开发与利用协同创新中心,广东湛江 524088)

牡蛎酶解产物的组成特点及其体外免疫活性

李婉1,曹文红1，2,章超桦1,2,*,秦小明1,2,高加龙1,2,郑慧娜1,2

(1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;2.广东省水产品加工与安全重点实验室,水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,国家贝类加工技术研发分中心(湛江),南海生物资源开发与利用协同创新中心,广东湛江 524088)

香港牡蛎是我国南方高产低值的一种海洋贝类。为了提高其附加值,本研究以香港牡蛎为原料,通过酶法水解结合细胞实验对酶解产物及其超滤组分进行组成特点分析和免疫活性评价。结果表明:牡蛎酶解产物及各超滤组分分子量分布主要集中在<2.5 kDa范围内,含量达53.00%～85.00%,且氨基酸组成齐全;牡蛎酶解产物可促进脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的免疫功能,各超滤组分(>10、10～5、5～2.5和<2.5 kDa)在浓度为0.25～4.0 mg/mL范围内,其体外免疫活性强弱具有一定的浓度相关性,且<2.5 kDa组分和5～2.5 kDa组分的免疫功能优于其他组分。牡蛎酶解产物各超滤组分中<2.5 kDa组分和5～2.5 kDa组分可作为进一步研究的对象。

牡蛎解产物,脾淋巴细胞,腹腔巨噬细胞,免疫调节

香港牡蛎(Crassostreahongkongensis)是我国南部沿海最主要的牡蛎养殖种类,主要分布在广东、广西地区,以其生长快速、个大肉肥而具有巨大的市场价值。

牡蛎是一种药食同源的食物,其入药在我国已有上千年的历史。《本草纲目》中对牡蛎早有记载:“多食之,能细活皮肤,补肾壮阳,并能治虚,解丹毒”。至今国内外学者对牡蛎生物活性进行了大量研究,如抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、改善记忆、ACE抑制剂、抑菌、解酒护肝等[1-8],但对于牡蛎的免疫活性功能报导较少。李超柱、YU[9-10]等主要研究了牡蛎酶解产物和多肽的免疫活性,但研究还处于基础阶段,研究对象大多是粗样品,成分复杂,有效成分含量少,氨基酸组成、肽序、相关的功能因子及其作用机制仍然未知。

本研究以香港牡蛎为原料,通过酶法水解结合体外免疫评价证明牡蛎具有免疫活性,且利用超滤、分离纯化等手段富集有效成分,有望为将来开发牡蛎免疫保健产品指明方向,同时为牡蛎高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜香港牡蛎肉 广东湛江东风市场;动物蛋白水解酶(酶活力23×104U/g) 广西南宁庞博生物工程有限公司;RPMI 1640 培养基、青/链霉素双抗 美国Gibco公司;胎牛血清 美国Gemini公司;磷酸盐缓冲液(PBS)、淋巴细胞分离液、红细胞裂解液 武汉市Biosharp公司;中性红 天津市天新精细化工有限公司;CCK8试剂盒 日本同仁公司;脂多糖(LPS) 美国Sigma公司;伴刀豆蛋白A(ConA) 上海源叶生物有限公司;Griess Reagent System 美国Promega公司;Folin-酚试剂盒 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

UV-2102PC型紫外分光光度计尤尼柯 (上海)仪器有限公司;热电Sorvall LYNX 6000高速落地离心机 广州市徳真科学仪器有限公司;VAPODEST 450全自动凯氏定氮仪 德国Gerhardt公司;高效液相色谱仪LC-20AD、UV-2550型紫外检测器 日本岛津仪器有限公司;FDU-1100型真空冷冻干燥仪 东京理化器械株式会社;WTM-CM-01陶瓷膜分离设备 杭州沃腾膜有限公司;FA2104A电子分析天平 上海天平仪器厂;SHZ-B型恒温水浴振荡器 江苏金坛市佳美仪器有限公司;旋转蒸发仪R-1005 郑州长城科工贸有限公司;HHT4-LX-C50L型立式压力蒸汽灭菌器 北京中西远大科技有限公司;CKX41型倒置显微镜 日本Olympus;SW-CJ-2FD型超净工作台 苏州净化有限公司;Forma 370型CO2恒温箱、Multiskan FC型酶标仪 美国Thermo公司;TDL-5-A低速离心机 上海安亭科学仪器厂;pHS-3C型精密pH计 上海康仪仪器股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 基本营养成分测定粗蛋白的测定 微量凯氏定氮法(GB/T 5009.3-2003);灰分的测定:高温灼烧法(GB/T 5009.4-2010);粗脂肪的测定:索氏提取法(GB/T 5009.6-2003);总糖含量的测定:硫酸-苯酚法;非蛋白氮的测定:三氯乙酸沉淀法。

1.2.2 水溶性多肽含量测定 Folin-酚试剂法参照文献[11]。

1.2.3 牡蛎酶解产物的制备 根据参考文献[3]稍作改进,取一定量牡蛎肉搅碎,加入三倍体积的蒸馏水匀浆,过80目筛网并调pH至7.0。牡蛎匀浆液在53 ℃恒温摇床中预热5 min,按1000 U/g加入动物蛋白酶酶解6 h,沸水浴中灭酶10 min,迅速冷却,酶解液6500 r/min离心20 min,收集上清液冷冻干燥备用。

1.2.4 超滤分级 利用200 μm无机陶瓷膜微滤装置过滤除去大分子物质、胶体颗粒及杂质。取上述获得的微滤液,选2.5、5、10 kDa超滤膜对其进行分级处理,得到>10、10～5、5～2.5和<2.5 kDa四个超滤组分。进口压力控制在0.25 MPa。

1.2.5 牡蛎酶解产物及其超滤组分分子量分布 根据参考文献[12]稍作改进,采用高效体积排阻色谱法(HPSEC)测定酶解产物及其超滤组分的分子量分布。色谱条件:色谱柱:Waters Protein-pak 60A(WAT085250);流动相为浓度0.05 mol/L,pH 8.3 的Tris-HCl缓冲液;洗脱速度为0.7 mL/min;柱温为25 ℃;进样体积为20 μL;检测波长为214 nm。标准品:溶菌酶(14300 Da)、维生素B12(1355.38 Da)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(429.47 Da)、L-酪氨酸(181.19 Da)。以保留时间(t)和分子量的对数lgM作图,得到分子量回归方法为:lgM=-0.4567t+8.9462(R2=0.9976)。

1.2.6 氨基酸组成分析 水解氨基酸的测定按照GB/T 5009.124-2003方法:取适量的牡蛎酶解产物、牡蛎酶解超滤产物组分干粉,加入6 mol/L的盐酸,110 ℃条件下水解22 h后,采用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样中的氨基酸含量。游离氨基酸检测:柱前衍生法[13]。

1.2.7 牡蛎酶解产物及其超滤组分的免疫活性评价

1.2.7.1 对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响 根据参考文献[12]稍作改进制备脾淋巴细胞悬液,确保活细胞数大于95%,最后将细胞浓度调整为3.0×106～5.0×106个/mL。将脾淋巴细胞悬液按100 μL/孔加入到96孔板中,等体积分别加入不同质量浓度的样品组分,刺激组加入适当质量浓度的ConA,以PBS替代样品作空白组,每组实验设6次重复。置于37 ℃,5% CO2孵育箱中培养48 h,培养完后加入10 μL CCK8溶液,混匀,放入孵育箱中继续培养2～4 h,在酶标仪上读出450 nm处吸光值。

1.2.7.2 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和生成NO能力的影响 根据参考文献[12]稍作改进,确保活细胞数大于95%,最后将细胞浓度调整为3.0×105～5.0×105个/mL。将腹腔巨噬细胞培养液按100 μL/孔加入到96孔板中,等体积分别加入不同质量浓度样品组分,刺激组加入适当质量浓度的LPS,以PBS替代样品作空白组,每组实验设6次重复。置于37 ℃,5% CO2孵育箱中培养48 h。

表1 新鲜牡蛎、酶解产物及其超滤产物组分基本营养组成比较(%)Table 1 Nutrition composition compared with the oyster,enzymatic hydrolysates and its ultrafiltration fractions(%)

注:以干基计。各组腹腔巨噬细胞培养48 h后,然后每孔加入100 μL 0.1%的中性红生理盐水,置于培养箱中再培养2～4 h,之后吸去上清液,用PBS缓冲液重复洗两次,洗完后再用移液枪取200 μL的细胞溶解液于96孔板中,使细胞溶解,溶解方法是室温条件下摇晃10 min,将96孔板置于酶标仪中,于540 nm处测其吸光度值,吸光度值可反映腹腔巨噬细胞的吞噬能力。

各组腹腔巨噬细胞培养48 h后,吸取每孔的上清液,使用一氧化氮测定试剂盒对小鼠巨噬细胞生成NO的能力检测,于540 nm处测其吸光度值,根据标准曲线得出NO的摩尔浓度。

1.3数据处理

表2 超滤膜处理前后不同组分各肽段占总肽含量比值(%)Table 2 Percentage change of different molecular weight ingredients in hydrolysates pre-and post-ultrafiltration(%)

2 结果与分析

2.1牡蛎、酶解产物及其超滤组分基本营养成分分析

牡蛎肉、酶解产物及各超滤组分基本营养成分组成见表1。由表1可看出,各超滤组分的粗蛋白含量高于新鲜牡蛎及其酶解产物,以干基计在60%左右,说明超滤分离后粗蛋白得到了浓缩。新鲜牡蛎与其酶解产物的总糖含量相差不大,总糖含量以干基计约为43.00%,但显著高于各超滤产物组分的总糖含量(p<0.05);在各超滤组分之间,总糖含量关系:>10 kDa组分与10～5 kDa组分相当,但这两个组分含糖量显著高于5～2.5 kDa组分(p<0.05),含糖量最低的是<2.5 kDa组分,含糖量以干基计为22.79%。牡蛎经过酶解超滤后非蛋白氮含量显著增加(p<0.05),各超滤组分>酶解产物>新鲜牡蛎,说明酶解效果较好,超滤分级具有富集小分子的作用。

2.2牡蛎酶解产物及其超滤组分分子量分布

采用HPSEC法测定牡蛎酶解产物及各超滤组分分子量分布,分子量分布图谱如图1所示,多肽含量分布及含量百分比见表2。由图1和表2可知,牡蛎酶解产物及各超滤组分多肽的分子量分布主要集中于<2.5 kDa范围内,含量百分比在53.00%～85.00%之间,且<2.5 kDa组分和5～2.5 kDa组分的小分子多肽含量明显高于其他组分,分别为84.66%和71.92%,分子量>10 kDa次之,2.5～5、5～10 kDa较少,显示酶解效果好,短肽含量高。目前发现的免疫活性肽类物质的相对分子量一般在2000 Da以下[14],这预示着牡蛎酶解产物超滤组分可能具有较强的免疫活性。免疫分子生物学研究指出,能够引起机体免疫排斥反应的物质的分子量通常在10000 Da以上[15],分子量小的小分子,不具备免疫原性,进入机体后不被机体识别,一般不能诱发免疫排斥反应。

图1 蛋白酶解产物及其超滤组分的分子量分布色谱图Fig.1 The molecular weight distribution of the protein hydrolysates from oyster and its ultrafiltration fractions

表3 酶解产物及各超滤组分氨基酸组成分析(g/100 g原料)Table 3 Composition and content of amino acid of the enzymatic hydrolysates from oyster and its ultrafiltration fractions(g/100 g raw material)

注:以干基计,*为必需氨基酸,Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Ala、Gly 7种氨基酸为疏水性氨基酸。

此外,牡蛎酶解产物及各超滤组分(>10、10～5、5～2.5、<2.5 kDa)水溶性多肽含量分别为22.32、23.68、22.31、26.09和32.80 mg/g,为体外免疫活性实验配制不同质量浓度的样品做准备。

2.3氨基酸组成分析

食物蛋白质中氨基酸组成对机体各种生理功能具有重要意义。牡蛎酶解产物及各超滤组分中氨基酸组成如表3所示。由表3可知,酶解产物及各超滤组分氨基酸种类齐全,分布均匀。5～2.5 kDa组分和<2.5 kDa组分水解氨基酸中必需氨基酸与氨基酸总和比值分别为39.24%、43.28%,必需氨基酸与非必需氨基酸比值分别为64.57%、76.30%,符合WHO和FAO推荐标准中理想蛋白质模式[16]。酶解产物与各超滤组分相比,其水解及游离氨基酸中疏水性氨基酸与氨基酸总和比值均低于各超滤组分,其中5～2.5 kDa组分和<2.5 kDa组分疏水性氨基酸与氨基酸总和比值明显高于其他组分。缬氨酸是一种疏水性氨基酸,更是人体所需的一种必需氨基酸,其与机体免疫、繁殖性能等密切相关[17]。各超滤组分(>10、10～5、5～2.5、<2.5 kDa)水解氨基酸中缬氨酸分别为2.59%、2.71%、2.66%、2.86%,游离氨基酸中缬氨酸分别为1.48%、1.67%、1.92%、1.94%,均高于酶解产物。各超滤组分水解和游离氨基酸中的谷氨酸、亮氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸含量均高于酶解产物,且5～2.5 kDa组分和<2.5 kDa组分中亮氨酸和苯丙氨酸含量最高。有研究显示[18-20],多肽的免疫活性与肽段中的疏水性氨基酸有关,绝大多数免疫活性肽中疏水性氨基酸占有较大的比例,且免疫活性肽的肽链末端为疏水性氨基酸。以陆生动物为原料进行的研究表明，缬氨酸可以提高免疫细胞增殖能力,促进免疫因子的分泌[21]。Yang Ruiyue等[22]发现马哈鱼蛋白水解多肽中的谷氨酸和亮氨酸能通过调节ConA的活性来增强免疫反应。程媛等[23]研究发现在大米中的阿片肽中存在一种结构,即含有Tyr-X-Phe序列,其中X可为一个或一个以上的氨基酸,这种结构是肽段保持阿片肽活性重要因素。综上可知5～2.5 kDa组分和<2.5 kDa组分达到较好蛋白质标准,且免疫活性优于其他组分。

2.4牡蛎动物蛋白酶酶解产物的免疫活性评价

2.4.1 对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响 如图2所示,牡蛎酶解产物在质量浓度为0.3、0.6 mg/mL时可刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,且0.6 mg/mL酶解产物组促进淋巴细胞增殖能力显著优于0.3 mg/mL酶解产物组(p<0.05),增殖率达到32.96%;ConA是非特异性有丝分裂源,单独作用于脾淋巴细胞时能够促进其增殖转化,与某些特异性抗原共同作用时,对促进脾淋巴细胞增殖转化有协同作用。由图2可知,在一定剂量范围内酶解产物能与ConA协同作用,提高脾淋巴细胞增殖转化能力,牡蛎酶解产物在0.6 mg/mL浓度下的细胞增值率39.90%。单纯牡蛎酶解产物组与ConA组相比,其对小鼠脾淋巴细胞增殖能力比ConA组低,ConA组分别为36.80%、48.62%。

图2 酶解产物对淋巴细胞增殖活性的影响Fig.2 Effect of the enzymatic hydrolysates from oyster on lymphocyte proliferation注:字母不同表示差异显著,p<0.05;图3～图7同。

2.4.2 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和生成NO能力的影响 巨噬细胞是具有吞噬、呈递抗原、分泌多种细胞因子的非特异性免疫细胞,能有效防御因病原体侵害而引起的炎症反应和组织损伤,是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,因此在先天性免疫中起重要作用。如图3、图4所示,酶解产物质量浓度为0.3、0.6 mg/mL时与空白组相比,浓度为0.3 mg/mL酶解产物对促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红差异不显著(p>0.05),浓度为0.6 mg/mL的酶解产物对促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和诱导生成NO都具有显著影响(p<0.05)。单独有丝分裂原LPS对诱导小鼠腹腔巨噬细胞生成NO具有剂量相关性,质量浓度为0.3 mg/mL时差距不显著(p>0.05),质量浓度为0.6 mg/mL时LPS组诱导作用显著高于酶解产物组(p<0.05)。

图3 蛋白酶酶解产物对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响Fig.3 Effect of the enzymatic hydrolysates from oyster on phagocytic function in peritoneal macrophages

2.5牡蛎酶解产物超滤组分的免疫活性评价

2.5.1 对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响 由图5可知,在0.25～4.0 mg/mL浓度范围内,随着质量浓度的不断升高,各组分对小鼠脾淋巴细胞增殖作用均呈现先上升趋势,且对脾淋巴细胞的增殖作用都显著高于单独有丝分裂原ConA组(p<0.05),说明各超滤组分对脾淋巴细胞具有增殖转化作用,效果明显。比较各组分对脾淋巴细胞增殖活性的影响,<2.5 kDa组分和5～2.5 kDa组分对脾淋巴细胞的增殖作用优于其他组分。不同物质对淋巴细胞增殖作用均存在最适作用剂量,即在此剂量下对淋巴细胞增殖作用最为显著,而高于或低于此剂量则有可能无增殖作用或增殖作用不明显。当质量浓度为0.5 mg/mL时,对促进脾淋巴细胞增殖活性效果优于马氏珠母贝超滤产物[24];当质量浓度为1.0 mg/mL时,效果优于波纹巴非蛤超滤产物[12]。

图4 蛋白酶酶解产物对腹腔巨噬细胞生成NO功能的影响Fig.4 Effect of the enzymatic hydrolysatesfrom oyster on NO secretion ability in peritoneal macrophages

图5 不同超滤组分对淋巴细胞增殖活性的影响Fig.5 Effect of different utrafiltration products on lymphocyte proliferation

2.5.2 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红功能的影响 如图6所示,各超滤组分在0.25～4.0 mg/mL浓度范围内,随着质量浓度的逐渐升高,各超滤组分对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红作用均呈现先上升后下降的趋势,且质量浓度均在1.0 mg/mL时对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红功能最好,当质量浓度大于1.0 mg/mL时,腹腔巨噬细胞吞噬中性红功能下降。在质量浓度为0.5 mg/mL时,比较各组分对腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响,<2.5 kDa组分和5～2.5 kDa组分优于其他组分,且具有显著性(p<0.05)。不同物质对腹腔巨噬细胞吞噬作用均存在最适作用剂量,即在此剂量下对腹腔巨噬细胞吞噬作用最为显著,而高于或低于此剂量则有可能无吞噬作用或吞噬作用不明显。黄演君等[25]研究了毛蚶多肽提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红功能的影响,在质量浓度为1.0 mg/mL时,吞噬功能最强,但低于牡蛎酶解产物超滤组分中<2.5 kDa组分和5～2.5 kDa组分。

图6 不同超滤组分对腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响Fig.6 Effect of different utrafiltration products on phagocytic function in peritoneal macrophages

2.5.3 对小鼠腹腔巨噬胞生成NO能力的影响 如图7所示,在0.25～4.0 mg/mL浓度范围内,各超滤组分均可明显促进小鼠腹腔巨噬细胞产生NO,并呈现一定的剂量依赖性,与空白组相比,各超滤组分诱导巨噬细胞生成NO的能力均高于空白组,且具有显著性(p<0.05)。与LPS组相比,低浓度时诱导生成NO强度与LPS组相当,随浓度的增加生成NO的能力降低,高浓度时低于LPS组。各超滤组分相比,<2.5 kDa组分和5～2.5 kDa组分这两个组分诱导腹腔巨噬细胞生成NO的能力优于其他组分,氨基酸组成差异可能是超滤所得肽段影响小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红、生成NO的主要因素之一。

图7 不同超滤组分对腹腔巨噬细胞生成NO的影响Fig.7 Effect of different utrafiltration products on NO secretion ability in peritoneal macrophages

3 结论

牡蛎是一种高蛋白、低脂肪的海产品,资源极为丰富。将其酶解并超滤分离后,酶解产物及其超滤组分的小分子肽和疏水性氨基酸含量较高,且氨基酸组成完善。通过体外免疫活性评价,结果显示牡蛎酶解产物质量浓度为0.3、0.6 mg/mL时,能有效促进小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的免疫功能。为了进一步确定牡蛎酶解产物免疫活性的分布,对酶解产物进行超滤富集,并结合细胞实验对其免疫活性进行分析评价,发现各超滤组分均具有免疫增强作用,其中<2.5 kDa组分和5～2.5 kDa组分对促进小脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的免疫功能效果更佳。但具体的活性物质还有待于进一步深入研究。

[1]Umayaparvathi S,Meenakshi S,Vimalraj V,et al.Antioxidant activity and anticancer effect of bioactive peptide from enzymatic hydrolysate of oyster(Saccostreacucullata)[J].Biomedicine & Preventive Nutrition,2014,4(3):343-353.

[2]Wang Q K,Li W,He Y H,et al.Novel antioxidative peptides from the protein hydrolysate of oysters(Crassostreatalienwhanensis)[J].Food Chemistry,2014,145:991-996.

[3]常格.牡蛎蛋白酶解产物抗疲劳作用研究及新产品研发[D].湛江:广东海洋大学,2016.

[4]Hao G X,Cao W H,Hao J M,et al.Invitroantioxidant activity andinvivoanti-fatigue effects of Oyster(Ostrea plicatula Gmelin)peptides prepared using neutral proteinase[J].Food Science Technology Research,2013,19(4):623-631.

[5]徐成,卢虹玉,章超桦,等.牡蛎酶解提取物对D-半乳糖致衰小鼠学习记忆的影响[J].食品工业科技,2016(2):347-351.

[6]Je J Y,Park J Y,Jung W K,et al.Isolation of angiotensin I converting enzyme(ACE)inhibitor from fermented oyster sauce,Crassostrea gigas[J].Food Chemistry,2005,90:809-814.

[7]Liu Z Y,Zeng M Y,Dong S Y,et al.Effect of an antifungal peptide from oyster enzymatic hydrolysates for control of gray mold(Botrytiscinerea)on harvested strawberries[J].Postharvest Biology and Technology,2007,46:95-98.

[8]黄健,欧昌荣,王求娟,等.牡蛎预防醉酒及对小鼠酒精性肝损伤保护的研究[J].中国食品学报,2012(10):29-33.

[9]李超柱,陈艳华,陈艳辉,等.牡蛎活性肽的分离及其免疫抑制作用的实验研究[J].海洋科学,2013,37(4):52-55.

[10]Wang Y K,He H L,Wang G F,et al.Oyster(Crassostreagigas)Hydrolysates Produced on a Plant Scale Have Antitumor Activity and Immunostimulating Effects in BALB/c Mice[J].Marine Drugs,2010,8:255-268.

[11]楼小红,陈建真.鹿茸中水溶性蛋白含量的测定[J].中国中医药科技,2003(1):31.

[12]何小庆.波纹巴非蛤活性肽的酶法制备及其免疫活性的研究[D].湛江:广东海洋大学,2014.

[13]杨月欣,王光亚.实用食物营养成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,2002.

[14]卜汉萍,王璐,许宙,等.免疫活性肽的酶法制备及其活性机制研究进展[J].食品与机械,2014,30(3):244-248.

[15]武汉大学,复旦大学生物学教研室.微生物学[M].北京:高等教出版社,221.

[16]章超桦,苏阳,曹文红,等.海南圆鮀鲣肌肉组织酶解产物抗疲劳活性的初步研究[J].食品科学技术学报,2017,35(1):43-49.

[17]李燕.鲈鱼和大黄鱼支链氨基酸与组氨酸营养生理的研究[D]. 青岛:中国海洋大学,2010.

[18]张亚飞.小麦蛋白Alcalase水解物中免疫活性肽的研究[D]. 无锡:江南大学,2008.

[19]Chen H M,Muramoto K,Yamauchi F.Structural analysis of antioxidative peptides from soybeanβ-conglycinin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995,43(3):574-578.

[20]Mercier A,Gauthier S F,Fliss I.Immunomodulating effects of whey proteins and their enzymatic digests[J]. international Dairy Journal,2004,14(3):175-183.

[21]Tsukishiro T,Shimizu Y,Higuehi K,et al. Effect of branehed-chain amino acids on the composition and cytolytic activity of liver-assoeiated lymphocytes in rats[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology,2000(15):849-859.

[22]Yang R Y,Zhang Z F.Immunomodulatory effects of marine oligopeptide preparatio from Chum Salmon(Oncorhynchusketa)in mice[J]. Food Chemistry,2009,113(2):464-470.

[23]程媛,曹慧,徐斐,等.食源性蛋白中免疫活性肽的研究进展[J].食品科学,2015,36(17):296-299.

[24]邓志程.马氏珠母贝全脏器免疫活性肽的制备及其免疫活性的研究[D].湛江:广东海洋大学,2015.

[25]黄演君,宋丽艳,于荣敏.毛蚶多肽提取物的体外免疫活性[J].中国生化药物杂志,2011(4):273-280.

Compositioncharacteristicsofoysterenzymatichydrolysateanditsimmuneactivityinvitro

LIWan1,CAOWen-hong1,2,ZHANGChao-hua1,2,*,QINXiao-ming1,2,GAOJia-long1,2,ZHENGHui-na1,2

(1.College of Food Science and Teachnology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Developmemt Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center,Zhanjiang 524088,China)

Hongkong oyster is a king of marine shellfish in southern China with high yield and low value.In order to increase its added value,this study took Hongkong oyster as raw materials,through enzymatic hydrolysis combined with cell experiment of hydrolysates and its ultrafiltration fractions analyzed the composition characteristics and immune activity evaluation. The results indicated that the oyster hydrolysates and its ultrafiltration fractions molecular weight distribution were mainly concentrated in the<2.5 kDa,and the content was 53.00%～85.00%,and the complete amino acid composition. The oyster hydrolysatesinvitrocan promote the immune function of mice spleen lymphocytes and peritoneal macrophages. Further study on the immune activity of oyster hydrolysates,in the concentration range of 0.25～4.0 mg/mL,invitroassays of cellular immune captivity of different ultrafiltration products(>10,10～5,5～2.5 kDa and<2.5 kDa)hasa certain concentration correlation,and<2.5 kDa and 5～2.5 kDa components have significant immunomodulatory effects.<2.5 kDa and 5～2.5 kDa afractions of each oyster hydrolysates ultrafiltration components may be used as an object for further study.

hydrolysates of oysters;spleen lymphocyte;peritoneal macrophages;immunoregulation

2017-04-07

李婉(1992-)，女，硕士研究生，研究方向：水产品加工与安全，E-mail:m18944942363@163.com。

*通讯作者:章超桦(1956-)，男，博士，教授，研究方向：水产品加工及高值化利用，E-mail:zhangch2@139.com。

国家现代农业产业技术体系(CARS-48-07B)。

TS254.2

:A

:1002-0306(2017)16-0035-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.008