张继远 刘晓谦 杨立新 冯伟红++王智民++李春

[摘要]對常山碱的稳定性及其降解动力学进行研究。结果表明，24 h内流动相作溶剂时，常山碱含量仅降低1%，但在水、甲醇、50%甲醇及10%乙腈溶液中其含量降低为起始含量的90%。当溶液pH介于3～7时，24 h内常山碱的保留率在98%以上，但在碱性溶液中（pH 90）含量降低约12%。温度越高，常山碱稳定性越差，40～80 ℃放置10 h后，常山碱降为起始含量的60%左右，但在20 ℃下放置10 h，其含量仅降低约5%；40，60 ℃放置10 h，常山碱主要转化为异常山碱，二者的总含量较起始总含量基本不变，但是80 ℃下放置10 h，常山碱和异常山碱的总含量降低为起始总含量的8333%，说明高温下常山碱结构发生了彻底改变，而不仅仅是异构化为异常山碱。光照对常山碱稳定性影响显著，强光照射108 h，常山碱质量分数较起始含量降低23%左右，但在避光和自然光条件下，其含量仅降低10%左右。无论在人工胃液（pH 14）还是人工肠液（pH 68）中，放置10 h后，常山碱质量分数降低均小于5%。常山碱固体在高温（60 ℃）、高湿[（75±1）%]和强光（3 000 lx）照射下放置10 d后，其含量分别减少027%，76%，539%。常山碱在水、甲醇、50%甲醇和10%乙腈溶剂中、碱性溶液、不同光照和不同温度（20，40 ℃）下的降解基本符合化学动力学一级反应。因此，无论是常山碱的制备纯化还是相关制剂的生产，都应在偏酸性溶液，低温、避光条件下快速操作完成，而常山碱固体则应在干燥、避光条件下保存。

[关键词]常山碱；稳定性；高效液相色谱法

Investigation on stability and degradation kinetics of febrifugine

ZHANG Jiyuan1，2，3， LIU Xiaoqian2，3， YANG Lixin2，3， FENG Weihong2，3， WANG Zhimin2，3*， LI Chun2，3

（1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；

2. China Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China）

[Abstract]To investigate the stability and degradation kinetics of febrifugine The results showed that within 24 hours， febrifugine content was decreased by only 1% in mobile phase solvent， but its content was decreased to be 90% of the initial content in the water， methanol， 50% methanol and 10% acetonitrile solution When the pH value of the solution was between 3 and 7， the retention rate of febrifugine in 24 hours was over 98%， but its content was decreased by about 12% in alkaline solution （pH 90） The higher the temperature， the worse the stability of febrifugine At 4080 ℃， the content of febrifugine was decreased to be 60% of its initial content in 10 hours， but the content was decreased by only 5% in 10 h at 20 ℃However， no matter 40 ℃or 60 ℃， febrifugine was mainly transformed into isofebrifugine， and the total content of febrifugine and isofebrifugine was equal to their initial total content in 10 hours， while incase of 80 ℃， the total content was decreased to be 8333% in 10 h， which suggested that the structure of febrifugine was absolutely changed， not just isomerized to be isofebrigugine at high temperature Light had a significant impact on the stability of febrifugine Under bright light， the content of febrifugine was reduced by about 23% in 108 h， but it only decreased by about 10% in the natural light or darkness In artificial gastric fluid （pH 14） and artificial intestinal fluid （pH 68）， the content of febrifugine was decreased by less than 5% in 10 h After storage at high temperature（60 ℃）， high humidity [（75±1）%] and strong light （3 000 lx） conditions for 10 d， the content of solid febrifugine was decreased by 027%， 76% and 539%， respectively The degradation of febrifugine basically complied with the firstorder reaction kinetic process in the following conditions： in water， methanol， 50%methanol and 10% acetonitrile solvents， alkaline solution （pH>7）， different light intensity and different temperatures （20，40 ℃）. Therefore， no matter the isolation and purification of febrifugine or the production of the related preparations， it should be done fast in the acidic solution， low temperature and dark conditions， while the febrifugine solid should be kept in dry and dark conditionsendprint

[Key words]febrifugine； stability； HPLC

常山碱是从中药常山Dichroa febrifuga Lour中分离制备出来的单体成分，是一种喹唑酮类生物碱，分子式C16H19O3N3，相对分子质量301。常山为虎耳草科植物常山D febrifuga的干燥根，是我国著名的截疟祛痰药，临床主要用于治疗疟疾[1]。研究发现常山中的常山碱（febrifugine）和异常山碱（isofebrifugine）是其抗疟的主要活性成分。常山碱和异常山碱性是一对同分异构体，在加热、酸、碱及不同溶剂中都易发生异构化改变[2]。但是，常山碱和异常山碱的活性却有很大不同，据文献报道[3]在鸡疟实验中，常山碱的抗疟活性约为奎宁的50倍，而异常山碱的抗疟活性约与奎宁相当。而且，近年来发现常山碱及其衍生物具有良好的抗肿瘤、免疫增强、促进伤口愈合以及治疗糖尿病、硬皮病等的作用[45]，这些研究结果说明常山碱具有广阔的应用前景。因此，保证常山碱的稳定性阻止其发生转化对于常山碱的应用具有至关重要的意义。虽然20世纪50年代就分离得到常山碱单体，但有关其稳定性的研究只在早期的文献[2]提到在一定条件下可与异常山碱发生互相转化，至今未见详细的文献报道。本文以自制常山碱样品为研究对象，考察了常山碱在不同溶剂、不同pH溶液、不同温度、不同光照强度，及在人工胃液和人工肠液中的稳定性，还考察了常山碱固体在高温、高湿和强光下的稳定性，并通过研究常山碱的稳定性，推导其降解动力学方程，研究结果可为常山碱的制备及相关制剂的生产提供参考。

1材料

11仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司），包括LPG3400分析泵、WPS3000SL自动进样器、TCC300柱温箱和DAD3000二极管阵列检测器。Shimadzu LC20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），包括LC20AT溶液传输单元、SIL20 A 自动进样器、SPDM20 A 二极管阵列检测器和LC solution色谱工作站。双压线性离子阱串联高分辨质谱OrbitrapVelos Pro（Thermo Fisher 公司），Ultimate 3000 超高效液相色谱仪（美国戴安公司）。布鲁克AⅢ 600 Ascend超导核磁共振仪（瑞士布鲁克公司）。MettlerDSC 1 System差示扫描量热仪（瑞士）。XS105DU型1/10万天平（瑞士，梅特勒托利多公司），KQ250DB超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司），SevenEasy S20台式pH酸度计（上海，梅特勒托利多公司），YB2型澄明度检测仪（天津瑞来特仪器有限公司）和WDA药物稳定性检查仪（天津鑫洲科技有限公司）。

12试剂

甲醇和乙腈为HPLC级（美国Fisher公司），水为纯净水（屈臣氏集团香港有限公司），氨水、三乙胺、冰醋酸、氯化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸和磷酸氢二钠均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），胰酶（批号F20060707）和胃蛋白酶（批号20160706）均为生化试剂（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

13对照品

常山堿对照品（批号151123，HPLC纯度≥98%）和异常山碱对照品（批号160114，HPLC纯度≥ 98%）均购自四川省维克奇生物科技有限公司。

2方法与结果

21自制常山碱样品纯度分析

211常山碱的制备常山药材粗粉，20倍量90%乙醇浸泡3 d，过滤，滤液回收乙醇至无醇味，剩余水液用氨水调节pH至10左右，氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，回收溶剂得浸膏。氯仿浸膏经反复硅胶柱色谱，氯仿甲醇（10∶0～9∶1）梯度洗脱，得常山碱粗品，无水乙醇反复重结晶，得常山碱。

212常山碱的结构鉴定白色针晶；mp：1854 ℃；HRESIMS m/z 302150 2 [M+H]+（计算值302149 9，C16H20O3N3）。氢谱和碳谱数据见表1，经与文献[6]对照，确定该化合物为常山碱。

214对照品溶液的制备取常山碱对照品2份，每份约10 mg，精密称定，加流动相溶解制成每1 mL含10 mg的溶液，即得。取异常山碱对照品适量，精密称定，加流动相溶解制成每1 mL含103 mg的溶液，即得。

215供试品溶液的制备取常山碱样品3份，每份约10 mg，精密称定，加流动相溶解制成每1 mL含10 mg的溶液，即得。

216测定结果实验人员共采用2 种色谱仪进行纯度分析试验。在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间至少3倍。在225 nm 下，除主峰外，可见杂质峰检出，按峰面积归一化法计算，纯度分别为9422%，9504%，9757%，9241%，9354%，9538%，均值（n=6）为9469%，RSD为19%。精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成1%自身对照溶液。精密吸取1%自身对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。计算1%自身对照纯度分别为9391%，9493%，9877%，9061%，9210%，9488%，均值（n=6）为9420%，RSD为30%。

22常山碱保留率的计算

取常山碱对照品适量，精密称定，用流动相溶解制成质量浓度为106 mg·L-1的溶液，作标准曲线并计算回归方程为y=61048x+0331 7（R2 =0999 7）。用上述方法分别测定常山碱水溶液处理前和经各种处理后的质量浓度，计算常山碱的保留率。常山碱保留率=ρt/ρ0×100%，其中，ρt为处理后t时刻常山碱的质量浓度（g·L-1），ρ0为处理前常山碱的质量浓度（g·L-1）。endprint

23常山碱降解动力学研究

对常山碱的稳定性研究可看作常山碱在溶液中的降解反应，可表示为：A→B+C+D+X，即d[A]/dt=-K[A]n，当t=0 h时，[A]的质量浓度为ρ0，当t时，[A]的质量浓度为ρt；若按一级反应处理（n=1），则ρt=ρ0exp（-Kt），ln（ρt/ρ0 ） =-Kt，以 ln（ρt/ρ0 ）-t作图，若为线性，则证明反应为一级反应，该直线的斜率为速率常数K。若为一级反应，根据t1/2=0692/K，计算常山碱的半衰期。

若测定得到不同温度下的速率常数，可根据化学动力学中阿累尼乌斯经验公式[7]，K=Ae-Ea/RT，其对数形式为lgK=-Ea2303RT+lgA，活化能Ea的计算：lg（K2/K1）=-Ea2303R（1T2-1T1），计算活化能Ea。

24不同溶剂中常山碱的稳定性研究

取常山碱样品5份，每份约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，分别加入水、甲醇、50%甲醇、10%乙腈和流动相溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含100 μg的样品溶液，常温（25 ℃）下分别于样品制备后第0，1，2，4，6，8，10，12，24 h进样，测定样品溶液中常山碱的质量浓度。结果见表2，3。

表2显示24 h后，常山碱在水、甲醇、50%甲醇、10%乙腈中都减少了约12%左右，而在流动相里却只减少了约1%，说明常山碱在流动相中更稳定。表3结果说明常山碱在水、50%甲醇、甲醇和10%乙腈中都基本符合一级反应（R2≥081，即相关系数r≥09），而其在流动相中的反应不属于一级反应。从半衰期上也可看出常山碱在流动相中最稳定，而在甲醇中降解最快。

25不同pH常山碱水溶液的稳定性研究

取常山碱样品适量，用水溶解并定容至刻度，制成每1 mL含308 μg的样品溶液。精密量取4份已配好的常山碱水溶液各1 mL，置10 mL棕色量瓶中，分别用pH为30（实测pH 279）、50（实测pH 554）、70（实测pH 724）和90（实测pH 875）的磷酸氢二钠（02 mol·L-1）柠檬酸（01 mol·L-1）缓冲溶液定容至刻度，摇匀，避光、室温下放置。分别于样品制备后第 0，2，4，6，8，10，12，24 h 取样，液相色谱条件下测定，记录不同pH下放置不同时间后样品溶液中常山碱的质量浓度。结果见表4，5。

由表4可以看出常山碱在酸性和中性溶液更稳定。在酸性和中性环境中放置24 h后，常山碱的保留率都在98%以上；而在pH为875的碱性溶液中，室温避光放置24 h后常山碱相对含量降为最初的884%。表5显示在碱性溶液中，常山碱的降解基本符合一级反应，而且在碱性条件下常山碱降解最快。结果提示，在提取分离制备常山碱对照品或者制备常山碱制剂时要尽量在酸性和中性环境下进行。

26不同温度下常山碱水溶液的稳定性研究

取常山碱样品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，用水溶解并制成每1 mL含846 μg的样品溶液。取上述溶液分装在2 mL的棕色口服液瓶中，密封保存。在避光条件下将上述样品溶液分别置于20，40，60，80 ℃恒温水浴锅中，并分别于放置后第 0，2，4，6，8，10 h取样，迅速冷却，HPLC测定不同温度下放置不同时间后样品溶液中常山碱的质量浓度。结果见图2，表6～8。

表6和表8均显示在20～60 ℃内随着温度的升高常山碱的降解速率逐渐加快，在60 ℃时常山碱的降解最快，而在80 ℃时降解速率又低于60 ℃的降解速率。常山碱和异常山碱为同分异构体，可能在60 ℃时常山碱最易转化为异常山碱。由图2和表7可看出常山碱在加热过程中有部分转化为异常山碱，但随着温度的升高，二者的总量在减少，说明

随着温度升高常山碱的结构发生了永久的改变，而不仅仅是转化为异常山碱的可逆性改变。表8显示，常山碱在20，40 ℃下降解反应基本符合一级反应，而60，80 ℃下不符合一级反应，温度升高常山碱迅速转化或者降解。常山碱在水溶液中降解反应活化能Ea为3653 kJ·mol-1，一般化学反应活化能在40～100 kJ·mol-1，小于40 kJ·mol-1为快反应，常山碱在的水溶液中降解反应活化能Ea为3653 kJ·moL-1，为快反应，说明温度对常山碱的稳定性影响较大。

27不同光照强度下常山碱水溶液的稳定性研究

取常山碱样品适量，精密称定，用水溶解并定容至刻度，制成每1 mL含894 μg的样品溶液。从样品溶液中等量取3份，每份15 mL，置于25 mL量瓶中，密封备用。将上述3份样品溶液分别置于暗室、日光下和澄明度检测仪（光照强度3 000 lx）中，作为避光、自然光和强光照射处理条件。在样品溶液放置后第0，12，24，36，72，84，96，108 h进样，测定样品溶液中常山碱的质量浓度。结果见图3，表9，10。

由表9可知，光照对常山碱水溶液的影响明显，强光照射下常山碱水溶液的稳定性最差，108 h后常山碱损失率达到24%左右；避光和自然光下的区别不大，常山碱损失率在10%～14%。图3显示

强光条件下常山碱主要转化为异常山碱。表10显示，无论是强光、自然光还是避光条件下，常山碱的降解都基本符合一级反应，由半衰期可看出，常山堿水溶液在避光条件下最稳定。以上结果提示常山碱在分离纯化过程中应尽量避光操作。

28人工胃液和人工肠液中常山碱的稳定性研究

人工胃液的制备：取稀盐酸164 mL加水约800 mL及胃蛋白酶10 g，搅匀后加水定容至1 000 mL，即得。人工肠液的制备：取磷酸二氢钾68 g，加水500 mL使溶解，用01 mol·L-1氢氧化钠调节pH至68。取胰酶10 g，加水适量溶解；将两液混合后加水稀释至1 000 mL，即得。endprint

取常山碱样品适量，精密称定，分别加人工胃液和人工肠液溶解并定容，制成浓度分别为857，817 mg·L-1的人工胃液和常山碱人工肠液溶液。将上述2种溶液置于37 ℃水浴锅内，分别在制备后第0，2，4，6，8，10 h取样，HPLC检测，测定放置不同时间后样品溶液中常山碱的质量浓度。结果见表11，12。

由表11可见常山碱在人工胃液（pH 14）和人工肠液（pH 68）中都比较稳定，常温放置10 h后常山碱较初始含量降低不足4%。表12显示在人工胃液和人工肠液中常山碱的降解均不符合一级反应。

29常山碱固体的稳定性研究

291高温试验取常山碱样品适量，置于敞口的棕色称量瓶中放在药物稳定性检查仪（60 ℃）中，于第5天和第10天取样，测定常山碱含量。

292高湿试验取常山碱样品适量，置于敞口的棕色称量瓶中放在干燥器[底部放有NaCl饱和溶液，相对湿度为（75±1）%，25 ℃]里密闭保存，于第5天和第10天取样，测定常山碱含量。

293强光照射试验取常山碱样品适量，置于敞口的透明称量瓶中于澄明度检测仪（3 000 lx）下照射，于第5天和第10天取样，测定常山碱含量，见表13。

由表13可知高温（60 ℃）对常山碱固体稳定性影响较小，在60 ℃下放置10 d常山碱含量几乎无变化；高湿环境下，常山碱固体含量降低约7%，这除了有常山碱异构化为异常山碱的改变外还和固体吸湿导致含量降低有关；但是经强光照射10 d后，常山碱含量降低约5%，说明光照对常山碱固体有较大的影响。因此，常山碱固体应在避光、干燥环境下储藏。

3讨论

迄今为止，国内外学者已经对常山碱的分离纯化、结构修饰和药理活性进行了大量研究，但对其稳定性的研究却很少。本文通过采用高效液相色谱测定相对含量的方法，比较了不同溶剂、不同pH水溶液、不同温度和不同光照强度，以及人工胃液和人工肠液中常山碱的稳定性。结果表明，常山碱含量随光照强度、温度、溶液pH的升高而迅速下降。相对而言，常山碱在酸性和中性环境中较稳定。人工胃液和人工肠液里常山碱都比较稳定，因为前者为酸性而后者为中性，这和前期发现的规律相吻合。影响因素试验是在比加速试验更激烈的条件下进行，其目的是探讨药物的固有稳定性、了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装、贮存条件和建立降解产物分析方法提供科学依据。本文依据2015年版《中国药典》中影响因素试验的要求，考察了常山碱固体在高温（60 ℃）、高湿[（75±1）%]和强光（3 000 lx）条件下的稳定性，结果发现高温下常山碱固体比较稳定，放置10 d后其含量基本没有变化；高湿条件下虽然常山碱含量降低7%左右，除了因为常山碱异构化为异常山碱外还和样品吸湿有关，还因为自制常山碱对照品较少因此并没有测定高湿前后样品中水分的含量，后续的实验中将会验证这一点；而在强光条件下，常山碱固体的外观虽然没有变化，但其含量明显降低，说明光照对其稳定性有较大影响。以上结果提示常山碱的制备纯化和相关制剂的生产都应该在酸性或中性溶液中、避光、低温快速操作完成，而常山碱固体应在干燥、避光条件下保存。

绝大多数单体成分在制备纯化和贮藏加工过程中都会受到各种因素的影响而降解，这些成分发生降解反应的动力学模型基本上符合零级或一级动力学反应模型。零级反应速度与反应物浓度无关，而受其他因素的影响，如反应物的溶解度或催化酶的浓度等，零级反应的半衰期与反应物起始浓度成正比。一级反应速率只与反应物浓度的一次方成正比，一级反应的半衰期与反应物起始浓度无关，是一个常数。本文测定了常山碱在不同条件下的化学动力学参数，结果发现其在常温下的多种溶剂（水、不同浓度甲醇和乙腈溶剂）中、碱性溶液（pH 875）、不同光照强度及不同温度（20，40 ℃）下的水溶液中的降解都基本符合化学动力学一级反应。但是温度再升高（60，80 ℃）时的降解反应并不符合一级反应。而药物的贮藏和制备通常在低温（4 ℃）或常温（25 ℃）下进行，因此今后的实验中将考查常山碱在上述温度下的化学动力学，若其符合一级反应，则可以应用动力学模型分别预测其在4，25 ℃下的半衰期及其架藏时间（含量降低10%的时间），相关结果将为常山碱类药物的研发提供依据。

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[責任编辑孔晶晶]endprint