蒲雅潔1，2， 王丹丹1，2， 闫艳1， 田洪岭3， 彭冰4*， 秦雪梅1，

马存根5， 杜晨晖5， 胡本祥6， 张福生1*

[摘要]产地与生长年限均为栽培中药中次级代谢物含量变化的主要影响因素。该研究通过建立超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱及采用多元统计的方法，分析生长年限与产地对栽培远志中次级代谢物含量变化的影响。结果显示：①产地因素对栽培远志中次级代谢物含量变化的影响大于生长年限；②蔗糖酯类和低聚糖酯类受产地因素影响较大，tenuifoliside B与tenuifoliside C在安国远志中含量较高，3，6′disinapoyl sucrose， tenuifoliose S， tenuifoliose L及tenuifoliose V则在汾阳远志中含量较高；③产地与生长年限均不是口山酮类成分含量变化的主导因素；④皂苷类成分受生长年限的因素影响较大，多数皂苷类次级代谢物含量随着生长年限延长有升高趋势。栽培远志中不同次级代谢物受产地与生长年限影响的程度不完全相同，本研究有助于栽培远志的良种选育及远志药材商品规格等级标准的修订。

[关键词]栽培远志； UPLCQTOF MS； 代谢组学； 产地； 生长年限

Analysis of influencing factors of secondary metabolites

contents in cultivated Polygala tenuifolia

PU Yajie1，2， WANG Dandan1，2， YAN Yan1， TIAN Hongling3， PENG Bing4*，

QIN Xuemei1， MA Cungen5， DU Chenhui5， HU Benxiang6， ZHANG Fusheng1*

（1 Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

2 College of Chemistry and Chemical Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

3 Institute of Industrial Crop， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Fenyang 032200， China；

4 Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to

Capital Medical University， Beijing 100010， China；

5 Shanxi University of Chinese Medicine， Taiyuan 030024， China；

6 Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）

[Abstract]This work was launched to explore the effect of habitat and growth year on the secondary metabolites contents of cultivated Polygala tenuifolia The samples of cultivated P tenuifolia were analyzed by ultrahigh performance liquid chromatography（UPLC）quadrupole timeofflight mass spectrometry（QTOF MS）， and the obtained data were analyzed using multiple statistical analysis and cluster analysis The results showed that compared with growth year， habitat is a main influencing factor which affected the secondary metabolites contents of P tenuifolia The contents of sucrose esters and oligosacchride multiesters are greatly dependent on the habitat （the sampleAG with high levels of components of tenuifoliside B and tenuifoliside C， and the sampleFY with high levels of 3，6′disinapoyl sucrose， tenuifoliose S， tenuifoliose L， and tenuifoliose V） There is no obvious effect of habitat and growth year on xanthone The contents of triterpene saponins are greatly dependent on the growth year， and the content of parts of triterpene saponins increased as time goes onThe result indicated that the effect of habitat and growth year on different types of secondary metabolites is not completely equivalent This study will contribute to the breeding of P tenuifolia and amendment of current commodity criteriaendprint

[Key words]cultivated Polygala tenuifolia； UPLCQTOF MS； metabolomics； habitats； growth year

远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd或卵叶远志P sibirica L的干燥根，是我国常用的大宗中药材之一，临床上具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿等功效[1]；作为多年生草本植物，其广泛分布于我国的东北、华北、西北、华中以及四川等地[2]。因远志的野生资源相对匮乏，目前商品远志药材主要以栽培品为主，其中山西产栽培远志占全国总销售量的50%以上[3]，而河北、陕西、山东等地也有远志药材销售；此外，不同产地商品远志药材生长年限长短不一，二～三年生的远志药材均可做商品销售。由于产地和生长年限是影响药材中次级代谢产物（药材的主要有效成分）积累变化的主要因素，而次级代谢物含量的高低又可间接反映药材的质量[4]。因此，为了更好地控制商品远志药材的质量，研究产地与生长年限对栽培远志中次级代谢物的影响就凸显出其重要意义。

超高效液相色谱（UPLC）具有超高速度、超高分离度、超高灵敏度等特点，而飞行时间质谱（TOF MS）则可将UPLC分离到的物质进行精确的相对分子质量测定，能对不同的组分进行精确定性。可见，UPLCQTOF MS在成分极其复杂的中药及复方药物研究中具有明显的优势[5]。植物代谢组学主要研究外界因素变化对植物造成的影响[6]，而代谢物数量或种类的变化则被认为是外界环境对植物影响的最终响应[7]，因此用植物代谢组学来分析外界环境对中药材的影响是十分必要的。本实验采用UPLCQTOF MS代谢组学技术，以山西新绛（栽培远志药材的主产地之一）产栽培远志药材（一，二，三年生）为主要研究对象，并结合河北安国（一，二年生）、山西汾阳（一，三年生）产栽培远志，分析产地和生长年限对栽培远志药材中次级代谢物含量变化的影响，该研究将有助于栽培远志的良种选育和远志药材商品规格等级标准的修订。

1材料

ACQUITY UPLC IClass/Xevo G2 Q TOF（Waters公司，USA）；超声波清洗器（KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司）；低速离心机（SC3600，上海亚荣生化仪器厂）；高速台式冷冻离心机（TGL16，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；旋转蒸发器（RE52A，安徽中科中佳仪器厂）。纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；乙腈（色谱纯，Tedia，USA）；其余试剂均为分析纯。

本实验所用栽培远志样品分别采于山西省新绛县北池村（XJ）、山西省汾阳市的山西省农科院经济作物研究所实验田（FY）、河北省安国市霍庄（AG）；采集各栽培远志样品，阴干，取根，经山西大学中医药现代研究中心的秦雪梅教授鉴定为远志科植物远志P tenuifolia的干燥根，留样保存于山西大学中医药现代研究中心。样品具体信息见表1。

从采集样品中随机抽取6～10株样品，粉碎，过药典3号筛，称取粉末05 g，精密称定，置具塞锥形瓶，加甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。所有样品均平行备样3份，每份进样2针。

2方法

21色谱条件

色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18（21 mm×55 mm，17 μm，美国Waters公司）。流动相：乙腈（A）和01%甲酸水（B）。梯度洗脱程序为 0～1 min，5% A；1～3 min，5%～12% A；3～6 min，12%～20% A；6～10 min，20%～30% A；10～105 min，30%～35% A；105～135 min，35%～45% A；135～15 min，45%～50% A；15～18 min，50%～95% A；18～19 min，95% A，流速 050 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量为2 μL[8]。

22质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为ESI-模式。雾化气体为高纯度氮气（N2），碰撞气体为高纯度氦气（He），扫描范围m/z 50～2 000，锥孔电压为40 V，毛细管电压为25 KV，离子源温度为100 ℃，脱溶剂气体温度为500 ℃，脱溶剂气体流速为800 L·h-1，锥孔气体流量50 L·h-1，碰撞能量（CE）50～80 V，LockMass为亮氨酸脑啡肽，m/z 554261 5[8]。

23数据处理

检索美国化学学会SciFinder数据库，将文献中有关远志化合物的数据进行全面收集整理，共收集到59种化合物信息。对UPLCQTOF MS原始数据进行預处理，得到质谱矩阵数据（矩阵由Waters公司自带软件TransOmicsTM生成），每个样品得3 614个变量，平行6份，共有7个样品，得数据矩阵42×3 614，对其峰面积进行归一化处理，并导入至SIMCAP 130（Umetrics，Ume，Sweden）软件进行主成分分析（PCA），同时采用SPSS 16（IBM SPSS，USA）软件依次对每一类次级代谢物进行聚类分析。次级代谢物的相对含量为其峰面积占总出峰面积的百分比，采用GraphPad Prism 50（USA）软件绘制栽培远志样品中次级代谢物的相对含量图。

3结果

31 栽培远志样品中次级代谢物的指认分析

本实验建立UPLCQTOF MS方法，分析不同产地与生长年限下栽培远志样品中的次级代谢物。因远志样品在负离子模式下的离子化效果优于正离子模式，因此本实验只采用电喷雾负离子模式检测。通过质谱和光谱数据及前期整理的化合物信息，本实验共推断指认出36个次级代谢物，见图1，2，表2，其中包括：6个蔗糖酯类（1～6），4个酮类（7～10），15个低聚糖酯类（11～25），11个三萜皂苷类（26～36）。见图1。endprint

311蔗糖酯类本实验共推断指认出6个蔗糖酯类物质（1～6）。化合物1产生m/z 517156 7[M-H]-分子离子峰，失去1分子蔗糖（sucroce）产生阿魏酰基碎片离子m/z 175039 1（C10H8O3），继而丢失CH3基团产生碎片离子m/z 160015 4。此外，化合物1失去324后产生碎片离子峰m/z 193048 6[ferulic acid-H]-。依据文献[9]，推断化合物1为阿魏酸与蔗糖成酯形成的sibiricose A5，见图。其余蔗糖酯类化合物结构的推导同化合物1，结果见图2，表2。

312酮类本实验共推断指认出4个酮类化合物（7～10），均以苷的形式存在。以化合物8为例，其在负离子模式下，产生m/z 537124 4[M-H]-分子离子峰，丢失1分子芹菜糖（132）产生碎片离子m/z 405082 6[M-H-Api]-，再丢失1分子H2O产生碎片离子m/z 387064 2[M-H-Api-H2O]-，继而分别丢失中性碎片C3H6O3（90）和C4H8O4（120），产生碎片离子m/z 297039 8和m/z 267029 8，该特征为黄酮碳苷类化合物的裂解规律[12]，m/z 243028 1为化合物8丢失1分子芹菜糖（132）与1分子葡萄糖（162）而产生的苷元离子。依据文献[9]，推断化合物8为sibiricaxanthone A，见图3。根据化合物7～10的裂解碎片，并参考文献[9]，推断这3个化合物也是黄酮碳苷类化合物，相应的化合物结构见图2，表2。

313低聚糖酯类远志中的低聚糖酯类（tenuifoliose A～P）具有共同的骨架结构，为葡萄糖（1→3）葡萄糖（1→3）葡萄糖（2→1）葡萄糖（1→1）果糖糖链与乙酰基、桂皮酰基类相结合[9]。本实验共推断指认出15个低聚糖酯类化合物11～25。化合物20产生m/z 1 337403 1[M-H]-分子离子峰，丢失阿魏酰基（C10H8O3）产生碎片离子m/z 1 161361 8，继而丢失桂皮酰基（C9H6O2）產生碎片离子m/z 1 015305 5；m/z 1 161361 8丢失中性碎片C2H2O和C2H4O2产生碎片离子m/z 1 119342 5和m/z 1 101337 8，再分别丢失桂皮酰基产生碎片离子m/z 997301 5和m/z 979283 1；m/z 1 161361 8丢失1分子苯甲酸（122）产生碎片离子m/z 1 039317 5。结合文献[910]，推断化合物20为tenuifoliose B，见图3。化合物11～19，21～25也表现出与化合物20类似的裂解行为，故参照化合物20的推导方法，推断其相应的化学结构，结果见图2，表2。

314三萜皂苷类远志中的皂苷主要为齐墩果烷型的五环三萜类，其C3位连接1个葡萄糖，称为A链，C28位为低聚糖酯链，称为B链；远志三萜皂苷间的结构差异，是由其C28所连接的糖类及酰基组的不同而造成[9]。本实验共推断指认出11个远志皂苷（26～36）。化合物33产生m/z 1 761726 1[M-H]-分子离子峰，丢失3OH3CH3戊二酰基

基团（HMG，144）产生碎片离子m/z 1 617686 2，再依次脱去3，4，5三甲氧基桂皮酸（TMCA，220）、葡萄糖（Glu）、H2O、CO2、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、芹菜糖（Api）和2个鼠李糖（Rha），产生碎片离子m/z 455317 0，继而再失去C27位的CH2O基团产生碎片离子m/z 425305 1。参考文献[9]，推断该化合物为onjisaponin V，见图3。化合物26～32，34～36表现出与化合物33类似的裂解规律，结合文献[911]，推断它们相应的化学结构，结果见图2，表2。

32栽培远志样品中次级代谢物含量变化的主要影响因素分析

PCA是代谢组学数据处理中最常用的一种无监督的模式识别方式[13]，因不对样品进行任何人为干预，PCA模型能反映数据的原始状态，可以总览数据是否存在潜在规律或者分组情况[14]。不同产地、不同生长年限下栽培远志的PCA散点图，FY位于t[1]轴的左侧，AG与XJ位于t[1]轴的右侧，表明AG，XJ样品与FY样品可以明显区分；AG位于t[2]轴的上部，XJ1，XJ2位于t[2]轴的下部，说明AG可与XJ1，XJ2明显区分；另，XJ3位于t[2]轴的上部，与XJ1，XJ2明显区分，而与AG1，AG2距离较近，表明XJ3体内的次生代谢物总含量更接近于AG，见图4。上述结果表明，在产地与生长年限因素的共同影响下，栽培远志中次级代谢物的变化受产地因素影响更大。

通过SPSS软件（ward法）对UPLCQTOF MS推断指认出的四类次级代谢物分别进行无监督的系统聚类分析，以明确每类次级代谢物含量变化分别受产地和生长年限因素影响的情况。图4B为不同栽培远志样品中蔗糖酯类成分的聚类图，当阈值为5时，远志样品被分为2类，即XJ与AG聚为一类，FY聚为一类；而当阈值为4时，XJ1，XJ2，XJ3聚为一类，AG1与AG2聚为一类，FY1与FY3聚为一类。图4C为不同栽培远志样品中酮类成分的聚类图，从图中可看出产地和生长年限均不是促使远志样品进行分组的主导因素。图4D为不同栽培远志样品中低聚糖酯类成分的聚类图，在阈值为3时，远志样品被分为3类，AG1与AG2聚为一类，XJ1，XJ2，XJ3聚为一类，FY1与FY3聚为一类。图4E为不同栽培远志样品中皂苷类成分的聚类图，在阈值为6时，远志样品被分为2类，XJ2，XJ3，FY3聚为一类，XJ1，FY1，AG2和AG1聚为一类。以上结果表明，栽培远志样品中的蔗糖酯与低聚糖酯类成分较易受产地因素的影响，皂苷类成分则较易受生长年限因素的影响，而产地与生长年限均对酮类成分有影响，但均不为主导因素。

33栽培远志样品中次级代谢物相对含量的变化规律分析endprint

用GraphPad Prism 50软件对次级代谢物的相对含量作图，并与本课题组之前研究的陕西合阳产远志（HY）的次级代谢物含量[8]进行比较，分析主要差异代谢物相对含量的变化规律。

栽培远志中4类次级代谢物的相对含量柱状图，见图5。图5A为栽培远志样品中蔗糖酯类成分的相对含量，对于一年生的栽培远志，AG，XJ，HY，FY4个产区蔗糖酯类成分的相对含量相近，以FY的略高；对于二年生的栽培远志，与AG2相比，XJ2高于AG2，而HY2则低于AG2（P<0001）；对于三年生的栽培远志，与FY3相比，XJ3高于FY3，而HY3则低于FY3。图5B为栽培远志样品中酮类成分的相对含量，在一年生的栽培远志中，AG1酮类成分的相对含量最低，HY1中的最高；在二年生的栽培远志中，与AG2相比，HY2高于AG2，XJ2高于AG2（P<001）；在三年生的栽培远志中，FY3中酮类成分的相对含量最高，与FY3相比，HY3与XJ3均低于FY3（P<0001），以HY3中酮类成分的相对含量最低。图5C为栽培远志样品中低聚糖酯类成分的相对含量，AG1，AG2中低聚糖酯类成分明显高于同一年限其余产地，其次为XJ1，XJ2。FY3中低聚糖酯类成分相对含量最低，HY3与XJ3均高于FY3（P<0001），以XJ3中最高。图5D为栽培远志样品中皂苷类成分的相对含量图，不同生长年限XJ远志中皂苷类成分的相对含量均高于HY，随着生长年限的延长，AG，HY，FY中皂苷的相对含量逐渐增多，以FY中皂苷类成分的增长最多。

其次，进一步对推断指认出的各次级代谢物相对含量进行比较分析，见图6。从化学成分分类的角度分析，蔗糖酯类代谢物中，以3，6′disinapoyl sucrose（4）与tenuifoliside A（5）的相对含量所占比例高，随着生长年限的延长，不同产地3，6′disinapoyl sucrose的相对含量均升高，且对于同一年限远志，3，6′disinapoyl sucrose的相对含量以FY>XJ>HY。而随着生长年限的延长，不同產地tenuifoliside A的相对含量则有降低趋势，但XJ降低的幅度小于其余产地，在二、三年生远志中，均以HY中tenuifoliside A的相对含量最低。AG中tenuifoliside B（3）与tenuifoliside C（4）的相对含量最高。FY中sibiricose A6（2）的相对含量最低。

酮类代谢物，以sibiricaxanthone A（8）与polygalaxanthone Ⅲ（10）所占的相对含量比例高，且FY3中二者的相对含量最高。HY1中lancerin（7），7Omethylmangiferin（9）的相对含量较其余产地有优势，但二者在HY3中的含量均降低，且均低于XJ3。

低聚糖酯类部分次级代谢物（11～19）随着生长年限的延长，其相对含量逐渐升高。FY中低聚糖酯类次级代谢物的相对含量，较其余产地有明显差异。tenuifoliose S（13），tenuifoliose L（16），tenuifoliose V（25）3个次级代谢物在不同年限的FY中均高于同年限的其余产地，而tenuifoliose F（15），tenuifoliose C（18），tenuifoliose B（20），tenuifoliose O（22），tenuifoliose A（23），tenuifoliose N（24）在不同年限的FY中，相对含量则均低于同年限的其余产地。

皂苷类次级代谢物中，以polygalasaponin ⅩⅩⅧ（27），onjisaponin L（29），senegin Ⅲ（32），onjisaponin Ⅴ（33），onjisaponin Fg（35）的相对含量比例高。AG中polygalasaponin ⅩⅩⅫ（26），onjisaponin Ⅴ（33），onjisaponin Fg（35）的相对含量高于同一年限的其余产地，FY中onjisaponin L（29），senegin Ⅲ（32）的相对含量较其余产地高。与HY3，FY3相比，XJ3中polygalasaponin ⅩⅩⅫ（26），onjisaponin Ug（30），onjisaponin Sg（31），onjisaponin Ⅴ（33），onjisaponin F（34），onjisaponin Fg（35）的相对含量较高。onjisaponin L（29）在不同生长年限下，相对含量的变化差异不大。而次级代谢物polygalasaponin ⅩⅩⅧ（27），onjisaponin Ug（30），onjisaponin Ⅴ（33），onjisaponin Fg（35），onjisaponin TH（36）随生长时间的延长，有逐渐升高的趋势。

4讨论

次级代谢物是中药材发挥药效的主要成分，远志中的四类次级代谢物均表现出一定的药理活性。糖酯类次级代谢物（蔗糖酯类、低聚糖酯类）具有改

善认知、脑保护、抗抑郁等作用[1518]。酮类次级代谢物具有止痛、抗菌、抗凝血等活性[15]。皂苷类次级代谢物可通过胆碱能效应[19]、抗神经细胞凋亡及抗氧化活性[20]、抗Aβ神经毒性[21]、改善海马区齿状回的长时效增强效应[22]、阻遏炎症信号通路减轻脾切除术后认知障碍[23]等机制，发挥抗痴呆、改善记忆障碍及脑保护等药理作用[24]。

鉴于次级代谢物的药理活性，其含量的高低决定远志的临床疗效。因此，本文采用UPLCQTOF MS代谢组学技术分析产地与生长年限2个因素对栽培远志中次级代谢物含量变化的影响，发现：产地因素对次级代谢物的影响大于生长年限；蔗糖酯类与低聚糖酯类受产地因素影响较大；产地与生长年限均对酮类有影响，但影响不显著；而皂苷类成分受生长年限影响较大，多数皂苷类次级代谢物含量随着生长年限延长有升高趋势。endprint

41远志药材在良种选育过程中应充分考虑种质的产地因素

不同产地远志药材次级代谢物含量的差异决定了药材品质的差异，在远志的主产区中，安国远志中低聚糖酯类成分的相对含量较高，但酮类成分相对含量较低；合阳远志中4类次级代谢物的相对含量均没有明显优势；新绛远志的蔗糖酯类成分、皂苷类成分的相对含量较高；汾阳远志的蔗糖酯类、酮类的相对含量高，而低聚糖酯类成分则含量较低。滕红梅等[25]对不同主产区远志药材中的远志皂苷元及多糖含量进行检测，认为闻喜、新绛远志中二者的含量处于较高水平，与本文结果一致。因此，远志药材在良种选育过程中，应充分考虑产地因素。

42修订远志药材商品规格等级标准时应考虑生长年限因素

生长年限作为影响栽培远志中次级代谢物含量变化的因素之一，主要影响皂苷类物质的含量，薛英等[8]发现，远志皂苷中的主要大类成分会随着生长年限的延长含量逐渐增加，与本文结果一致。滕红梅等[26]对不同生长年限栽培远志的产量及远志总皂苷元含量进行分析，认为三年生栽培远志中远志总皂苷元的含量最高。因此，在今后修订远志药材商品规格等级标准时，应充分考虑生长年限因素，做到更合理的等级划分。

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[责任编辑丁广治]endprint