基于UPLCQTOF/MS技术的北青龙衣褐变过程中成分动态变化分析

2017-09-09孙国东霍金海谢荣娟王伟明

中国中药杂志 2017年16期

孙国东++霍金海++谢荣娟++王伟明

[摘要]该文分析不同褐变时期北青龙衣有效成分动态变化规律。采用UPLCQTOFMS/MS技术对13个褐变时期26批样品进行测定，差异性化合物通过Peakview 20/masterview10软件，依据精确质量数和同位素峰度比确定分子式，再通过与对照品及质谱数据库的二级谱图比对、裂解规律分析，并结合已有文献报道，确定结构式。结果不同褐变时期化学成分含量发生了明显的变化，鉴定或推断了北青龙衣中25个化合物结构，随着褐变时间的变化，13个萘醌类化合物中，具有胡桃醌相似母核的6个化合物及3个萘醌苷类化合物的含量显著下降，产生胡桃酮等4个萘醌衍生物；4个黄酮及2个酚酸类化合物含量显著下降；6个二芳基庚烷类化合物显著提高。该方法能够快速、准确鉴定北青龙衣的化学成分，并分析动态变化规律，为揭示褐变对中药材及果蔬成分的影响提供一种新的研究策略。

[关键词]液相色谱四极杆飞行时间质谱；北青龙衣；褐变；动态变化

Dynamic variation of components in exocarp of Juglans mandshurica with

browning based on UPLCQTOF/MS

SUN Guodong， HUO Jinhai， XIE Rongjuan， WANG Weiming*

（Institute of Chinese Materia Medica， Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Sciences， Harbin 150036， China）

[Abstract]To analyze the dynamic changes in components in exocarp of Juglans mandshurica at different browning periods Twentysix batches of exocarp of J mandshurica samples from thirteen browning periods were assessed by UPLCQTOFMS/MS The formula of different compounds were determined by accurate mass and isotopic abundance ratio from target screening function of Peakview 20/masterview10 software Then their structures were determined by analysis of MS/MS fragment or comparison with standard substances and references The contents of chemical components were changed significantly in different browning periods and twenty five compounds were identified or inferred Of the 13 naphthoquinone compounds， the contents of 6 compounds with similar parent nucleus as juglone and 3 naphthoquinone glycosides compounds were decreased significantly， and 4 naphthoquinone derivatives such as regiolone were produced； the contents of four flavones and two phenolic acids compounds were decreased significantly； and the contents of 6 diarylheptanoids compounds were increased significantly UPLCQTOF/MS method can be used to identify and analyze the chemical constituents from exocarp of J. mandshurica rapidly and accurately， and analyze the rules of dynamic changes， to reveal the browning of Chinese medicinal materials and its effects on compositions of fruits and vegetables.

[Key words]LCQTOF/MS； exocarp of Juglans mandshurica； browning； dynamic variation

北青龍衣为胡桃科胡桃属植物核桃楸Juglans mandshurica Maxim未成熟果实的外果皮。民间多年来一直用于治疗恶性肿瘤，国内外学者对其抗肿瘤活性进行了大量的报道[12]。北青龙衣在鲜切过程中发生严重的褐变反应，由绿色逐渐变为黄绿色，干燥后变成棕褐色或黑褐色[34]。目前，关于褐变对北青龙衣化学成分及品质的影响研究尚未见报道。

植物经过一系列反应产生褐色聚合物的过程称褐变反应，简称褐变，分为酶促褐变和非酶促褐变。褐变是中药材、果蔬食品加工中普遍存在的一种变色现象，并严重影响其外观、营养价值及市场价格。近年来，国内外学者对百合、枸杞、葛根、山药、天麻、金银花、牡丹皮、苹果、大蒜、莲藕、荔枝、马铃薯等易发生褐变的药材、果蔬食品中褐变现象及其多酚氧化酶酶学特性进行了广泛而深入的研究[56]。endprint

目前，关于褐变对中药材及果蔬品质的影响多集中于外观性状、折干率、复水率等指标的检测，总多糖、总酚、总黄酮以及绿原酸、木犀草苷、没食子酸等常见化合物的含量测定，难以全面反映褐变对中药材及果蔬化学成分的整体影响[711]。近年来，将液相色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度相结合，尤其是与高分辨质谱和多级质谱联合使用的技术手段，已广泛应用于中草药成分的全面分析[1213]。

本研究采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLCQTOF/MS）技术对不同褐变时期北青龙衣进行在线分离分析研究，确定其主要化学成分变化。利用UPLC维的保留时间锁定化合物，通过二维的精确质量数和同位素峰度比确定分子式，再通过对照品比对或质谱裂解规律分析确定或推断其结构式，通过有效成分动态变化分析，以期为阐释褐变对北青龙衣品质的影响提供科学依据，亦为研究褐变对中药材及果蔬的影响研究提供借鉴和参考。

1材料

11仪器

ACQUITY UPLC（美国Waters 公司，包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱）；AB SCEIX TripleTOFTM 5600+质谱仪（AB SCIEX，USA，配有 ESI 源和APCI源），数据采集软件：Analyst TF 16 software（AB SCEIX，USA）；数据处理软件系统：Peakview 20/masterview10 software（AB SCEIX，USA）、Markerview121（AB SCEIX，USA）；Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（21 mm×100 mm，17 μm），AQUITY UPLC BEH C18 VanGuard PreColumn 预柱（21 mm×5 mm，17 μm）。

KQ300DB型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；BSA224SCW型电子天平（赛多利斯科学仪器公司）；LG16W型高速离心机（北京京立离心机有限公司）。

12试剂与对照品

甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，Merck，Germany），甲酸（色谱纯，Fisher，USA），蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。胡桃醌对照品（供含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司提供，批号H075131230）。

13药材

北青龙衣于2015年6月29日采自哈尔滨市方正县（东经128°92′621″，北纬45°62′828″），经初东君主任药师鉴定为胡桃科植物核桃楸J mandshurica的果实。剥取外果皮，至阴凉通风处，分别于0，4，8，12 h，1，2，3，4，5，6，14，21，28 d平行取2份样品用于供试品溶液制备，同时测定水分。

2方法

21对照品溶液的制备

精密称取胡桃醌对照品适量，加甲醇制成约50 mg·L-1的溶液作为对照品溶液。

22供试品溶液的制备

取不同褐变时期北青龙衣药材（0 h～1 d样品取5 g；2～3 d样品取2 g；4～28 d样品取1 g），加甲醇25 mL，精密称定，超声处理30 min（功率300 W，频率40 KHz），放冷，补足甲醇，摇匀，滤过，取续滤液于-80 ℃冻存，分析前恢复室温，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得。

23色谱条件

Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（21 mm×100 mm，17 μm），AQUITY UPLC BEH C18 VanGuard PreColumn 预柱（21 mm×5 mm，17 μm），柱温30 ℃，流动相A为01%甲酸水，B为01%甲酸乙腈，梯度洗脱（0～3 min，5%～22% B； 3～15 min，22%～60% B； 15～20 min，60%～70% B； 20～29 min，70%～100% B； 29～30 min，100% B；30～301 min，100%～5% B； 301～35 min，5% B），流速03 mL·min-1，进样量2 μL。

24质谱条件

课题组前期研究表明，北青龙衣所含化合物在正离子模式下具有较好的响应。因此，采用ESI 离子源，离子化模式为电喷雾正离子模式，离子源电压为5 500 V，离子源温度为 550 ℃，裂解电压（DP）分别为 80 V，碰撞能量（CE）分别为 35 eV，碰撞能量扩展（CES）分别为 15 eV。雾化气体为氮气，辅助气Gas1为 55 PSI，辅助气Gas2 为 55 Psi（1 Psi=6895 kPa），气帘气Cur Gas为 35 Psi。一级质谱母离子扫描范围为 m/z 80～1 500，IDA 设置响应值超过100 cps 的 8 个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为m/z 50～1 500，开启动态背景扣除（DBS）。数据采集软件：Analyst TF 16 software（AB SCEIX，USA）；数据处理软件：Peakview 20/masterview10 software（AB SCEIX，USA）。

25数据分析

251目标性筛查使用peakview20（AB SCEIX，USA）软件中的MasterView功能载入已选择的数据，利用已建成的胡桃属植物268种化合物一级质谱数据库，设置Mass Error（质量数偏差）<5×10-6；权重30%，Isotope（同位素分布）差异<10%；权重40%，Formula Finder score（分子式查找）>70%；权重40%，利用masterview10软件目標筛查功能对组分样本进行筛查。系统可以显示该离子在不同褐变时期内的XIC峰面积变化，便于半定量分析。也可针对萘醌类、黄酮类、二芳基庚烷、三萜、酚酸等北青龙衣已报道化合物，在一定的保留时间区域范围，可利用masterview10软件特征性子离子扫描功能对不同褐变时期样本进行筛查，分析不同类成分相对含量的变化趋势。endprint

252非目标性筛查将采集数据导入MarkerView（AB SCIEX，USA）软件，通过peak finding options功能将数据中所有色谱峰按照设置参数母离子强度>3 000 counts，S/N>10；MAX Element C50H200O50提取出来，这类化合物将作为分析的重点目标，显示每个离子在不同褐变时期内的XIC峰面积变化，分析相对含量的变化趋势。

26结构鉴定

在正离子模式下，大多数化合物会产生[M+H]+分子离子，Triple TOFTM 5600+高分辨质谱能够在5×10-6误差范围内测定大多数离子的精确质量数，并准确测定同位素丰度比。因此，通过Peakview 20 software软件的Formula Finder功能，依据精确质量数及同位素丰度比可确定化合物的分子式。对于有对照品的化合物，进一步比对保留时间及二级质谱信息进行结构鉴定；对于无法获得对照品的化合物，首先，依据其碎片离子的精确质量数计算其碎片组成，对比chemspider数据库给出的可能结构式，再研究相似结构化合物的质谱裂解规律，通过Peakview 20软件分析化合物质谱裂解特征以及文献对比，结合二级谱图相似度，从而推测化合物结构。

3结果

31UPLCQTOF/MS结果

正离子模式下，各褐变时期样品色谱峰均得到了良好的分离，且彼此间存在较大差异，见图1。

32北青龙衣成分的鉴定

课题组前期已对北青龙衣成分的裂解规律及鉴定进行了系统的研究[1415]。例如，萘醌类化合物是北青龙衣中主要的抗肿瘤活性物质，准分子离子连续失去H2O和CO是其典型的质谱裂解规律[1617]。以化合物1为例，其准分子离子175[M+H]+丰度比较高，易失去CO中性碎片形成丰度最高的147[M+H-CO]+碎片离子，在高能碰撞下发生开环反应形成133[M+H-CO-CH2]+，121[M+H-CO-C2H2]+ 2个丰度较小的碎片离子，准分子离子175[M+H]+亦能丢失1分子H2O形成丰度较小的157[M+H–H2O]+离子，并连续丢失CO碎片形成129[M+H-H2O-CO]+，101[M+H-H2O-2CO]+ 2个碎片离子。此裂解途径与胡桃醌对照品二级碎片基本吻合，因此，鉴定化合物1为胡桃醌（juglone），其二级质谱、裂解可能途径以及离子碎片数据计算分别见图2，3，表1。

33褐变过程中成分动态变化规律分析

依据25项下化合物的筛查与鉴定的方法，共确定了不同褐变时期北青龙衣中25个具有明显变化规律的化合物结构。其中13个萘醌类化合物，分别具有胡桃醌结构、萘醌苷类、萘醌衍生物见图4，6个黄酮及酚酸类化合物见图5，6个二芳基庚烷类化合物见图6，质谱鉴定及对比信息见表2～4。

具有胡桃醌相似母核的6个化合物的含量在褐变过程中均表现为明显下降趋势，14 d以后含量降至较低范围。Premithramycinone H 和3，8，8′三羟基2，2′联1，1′，4，4′二萘酮在第28天后完全转化，质谱未测到其准分子离子。胡桃醌、5羟基2甲氧基1，4萘醌、5羟基3，3′双胡桃醌、3，3′双胡桃醌4个化合物在第28天与第0天比较，分别降低至原质量分数的777%，286%，227%，636%，说明北青龙衣褐变过程中胡桃醌类化合物发生转化，含量明显降低。

3个萘醌苷类化合物的含量在褐变过程中均表现为明显下降趋势。其中1，4，8三羟基萘1OβD吡喃葡萄糖苷在刚刚发生褐变4 h后，含量迅速下降，并于2 d后降到较低值，保持稳定，第28天后降低至原质量分数的490%；4，5，8三羟基α四氢萘酮4OβD吡喃葡糖苷与1，

逐渐下降，并于2 d后降到较低值，保持稳定，第28天后降低至原质量分数的760%，952%，推测核桃青皮切开后，相关葡萄糖苷水解酶迅速发挥作用，导致萘醌苷类化合物快速水解，2 d后基本水解完全，酶逐渐失去活性，萘醌苷残存量均在10%以下。

4个萘醌衍生物的含量在褐变过程中均表现为明显增加趋势。其中核桃酮、5羟基1，4萘酮、1，5萘二酚为褐变过程中产生的3个新化合物，并随着褐变时间的延长，含量明显提高；4[（1，4二氢8羟基1，4二氧代2萘基）氨基]丁酸在褐变过程中含量显著增加，28 d后含量提高389倍。

由图5可知，儿茶素、槲皮素、槲皮素3OβD葡萄糖苷、泽兰苷等4个黄酮类化合物以及绿原酸、咖啡酸2个酚酸类化合物在褐变过程中均表现为明显下降趋势，在第28天与第0天比较，分别降低至原质量分数的180%，890%，967%，2011%，3465%，1806%。

由图6可知，1 （4′甲氧基苯基）7苯基 3′，4″环氧3庚酮、1 （4′甲氧基苯基）7苯基 3′，4″环氧3庚醇、1 （4′甲氧基苯基）7苯基 3′，4″环氧3庚酮、1 （4′羟基苯基）7（2″羟基3″甲氧基苯基）3′，4″环氧3庚酮、1 （4′甲氧基苯基）7苯基 3′，4″环氧3庚醇、茸毛香杨梅酮等6个二芳基类化合物在褐变过程中均表现为明显上升趋势，在第28天与第0天比较，分别升高2588，401，418，516，1356，243倍。

随着褐变时间的变化，13个萘醌类化合物中，具有胡桃醌相似母核的6个化合物及3个萘醌苷类化合物的含量显著下降，产生胡桃酮等4萘醌衍生物；4个黄酮及2个酚酸类化合物含量显著下降，6个二芳基庚烷類化合物显著提高。

4讨论

不同褐变时期样品含水量存在较大差异，前期测定表明1 d内含水量在80%左右；2～3 d 60%左右；3 d后降低至20%以下。因此，采用同一来源样本不同取样量及相同处理方式制备样品，进样前用甲醇调整折算至同等取样量，保证了数据齐同可比。endprint

本研究采用目标与非目标筛查相结合的方法，能够最大限度发现北青龙衣中的有效成分及主成分，并通过XIC峰面积变化快速分析成分的变化规律。研究过程中发现，目前，以胡桃醌含量测定为主的青龙衣质量控制方法存在较大缺陷，胡桃醌性质不稳定，难以准确反映青龙衣药材真实质量。因此，课题组前期建立的以转化产物胡桃酮或二者同时测定的含量测定方法具有重要的应用价值[18]。

目前，褐变现象对中药材成分、药效及毒性的影响尚不清楚。文献报道及课题组前期研究已证实胡桃醌（5羟基1，4萘醌）是北青龙衣的主要毒性物質基础[1920]，褐变过程中转化可能是减毒重要机制之一。课题组在新药研发过程中，证实胡桃酮是一种高效低毒的抗肿瘤化合物，为褐变过程中新产生的化合物。二芳基庚烷化合物具有良好的抗肿瘤活性，本文首次发现了褐变过程中二芳基庚烷化合物的含量显著提高。这与前期研究表明褐变后的北青龙衣干品抗肿瘤活性略高于鲜品一致[21]。且根据人工合成二芳基庚烷的途径和方法也有学者推测小分子酚酸类成分是植物体内生物合成的关键前提[22]。黄酮及酚酸类成分的含量下降可能与核桃青皮中多种活性酶催化其作为底物合成二芳基庚烷类有关，为转化提供了前体原料。数十年来，二芳基庚烷化合物全合成也一直吸引着合成化学家的密切关注，但其结构复杂，人工合成十分困难。因此，笔者认为利用酚酸类成分结合植物体内源性酶生物合成二芳基庚烷类化合物较化学合成更有前途。

总之，本文建立的基于UPLCQTOF/MS技术的北青龙衣褐变成分动态变化分析策略为理解褐变过程中成分变化提供了新的视角，对中药材及果蔬褐变研究具有一定的借鉴作用。

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