雷湘兰，沈振国，孙倩*，郑金明

（海南职业技术学院热带农业技术学院，海南海口570216）

一株椰糠纤维降解菌的分离、鉴定及特性研究

雷湘兰，沈振国，孙倩*，郑金明

（海南职业技术学院热带农业技术学院，海南海口570216）

以椰糠作为碳源，从红树林土壤中分离了一株高产纤维素酶的真菌，命名为DZ10。经形态、生理生化和分子生物学试验，鉴定菌株DZ10为长枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）。该菌在pH值为6.5、培养温度为35℃、初始NaCl含量为2.0%、添加K+终浓度为0.1mmol/L条件下，椰糠降解率最高为39.88%；在pH值为6.5、培养温度40℃、初始NaCl含量3.0%、添加K+终浓度为0.1mmol/L条件下，羧甲基纤维素酶活力（CMCA）最高值为80.07U/m L；在pH值为6.0、培养温度35℃、初始NaCl含量1.5%、添加K+终浓度为0.1mmol/L条件下，滤纸酶活力（FPA）最高值为73.81U/m L。Ca2+、K+对菌株DZ10产酶和椰糠降解率有促进作用，Mg2+抑制菌株DZ10产酶和椰糠降解率。

椰糠；纤维素酶；分离；鉴定；降解

我国热带地区椰子资源丰富，椰果加工后的留下大量的椰糠，椰糠纤维素的含量约为24%，经过处理后可用于有机肥料生产、沼气发酵、饲料添加等[1-2]。但大多数的椰糠被当作废弃物堆积或焚烧处理，既污染环境又造成资源浪费。

微生物降解纤维素具有高效、环保等特点，微生物纤维素酶在酿造业中应用广泛[3]。本研究从红树林环境中分离筛选可降解椰糠纤维素的真菌，分离到9株纤维素降解菌株，最终筛选出1株纤维素酶高产菌株，并对椰糠纤维的降解特性做了分析比较，以期为椰子废弃物纤维素资源的综合利用和纤维素酶制剂开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土样：海南东寨港红树林土壤。

磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；椰糠：市售。

椰糠纤维菌筛选培养基：KH2PO41.0 g，MgSO40.2 g，（NH4）2SO40.5 g，红树林灭菌海水100m L，椰糠粉4.0 g，庆大霉素1m L，蒸馏水900m L，琼脂18.0 g，pH 6.8。

羧甲基纤维素钠培养基：CMC-Na15.0 g，磷酸二氢钾1.5 g，氯化钠0.5 g，硫酸镁0.3 g，蛋白胨10.0 g，蒸馏水1 000m L，琼脂18.0 g，pH 6.8。

产酶培养基：椰糠粉10.0 g，NaCl5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.2 g，蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖1.0 g，蒸馏水1 000m L，pH 6.8。

椰糠液体培养基：椰糠粉20 g，NaCl5.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO41.0 g，葡萄糖1.0 g，（NH4）2SO42.0 g，蒸馏水1 000m L，pH 6.8。

1.2 仪器与设备

1-16k台式高速冷冻离心机：德国Sigma公司；T100PCR仪：美国伯乐公司；DYY-8C电泳仪：北京六一仪器厂；ZWY-2102立式中型全温摇床、ZXSR-1090生化培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司；GenШM icrostation BIOLOG自动微生物鉴定系统：美国BIOLOG公司；MagMax Express自动核酸提取仪：美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 椰糠纤维素降解菌初筛

取5g土样溶解于50m L无菌蒸馏水中，旋涡振荡10m in，悬液按10-1～10-5进行梯度稀释，选择合适稀释度的菌液涂布于椰糠纤维菌筛选培养基上。培养皿28℃倒置培养，将长出的菌落挑取在真菌分离纯化培养基上反复划线纯化，纯化后的菌株接种于真菌试管斜面培养基4℃保藏。获得的纯菌株点种于羧甲基纤维素钠培养基上，28℃培养72 h，在培养基中加入1mg/m L刚果红染液染色1 h，以1mol/L NaCl溶液冲洗并浸泡1 h，弃去NaCl溶液，观察测量透明圈直径（D）和菌落直径（d），以透明圈直径和菌落直径的比值大小D/d作为产纤维素酶能力的判断依据。

1.3.2 椰糠纤维素降解菌复筛

（1）粗酶液制备：初筛获得的菌株接种于产酶培养基中，30℃、140 r/m in摇床培养6 d，取10m L发酵液4℃、3 500 r/min条件下离心20m in，吸取上清液保存备用。

（2）酶活测定：配制葡萄糖标准溶液，以二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法绘制葡萄糖标准曲线[4]。

1.3.3 菌种鉴定

（1）形态观察：参照《真菌鉴定手册》[5]。

（2）生理生化鉴定：以Biolog系统做碳源同化分析。

（3）分子鉴定：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增中度保守的ITS区域，扩增条件见表1。扩增产物进行测序及提交GenBank序列比对。

表1 PCR扩增条件Table 1 Amplification condition of PCR

1.3.4 椰糠降解特性试验

（1）不同pH对菌株降解椰糠的影响：用磷酸缓冲液调整椰糠液体培养基pH值，分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培养基于30℃、120 r/min振荡培养6 d，计算不同pH值椰糠降解率。取10m L发酵液4℃、3 500 r/min条件下离心20min，吸取上清液测定羧甲基纤维素酶活（carboxymethylcelluloseenzymeactivity，CMCA）与滤纸酶活（filterpaperactivity，FPA）。

（2）不同培养温度对菌株降解椰糠的影响：培养温度设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，在最适pH值条件下120 r/m in振荡培养7 d，计算不同培养温度椰糠降解率，测定CMCA与FPA。

（3）不同初始NaCl含量对菌株降解椰糠的影响：椰糠液体培养基分别添加初始NaCl含量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%，在最适pH值和培养温度条件下，120 r/m in振荡培养7 d后，计算不同初始NaCl含量椰糠降解率，测定CMCA与FPA。

（4）金属离子对菌株降解椰糠的影响：椰糠液体培养基分别添加CaCl2、MgCl2、MnSO4、KCl、CuSO4、FeCl2、ZnSO4，使各金属离子的终浓度为0.1mmol/L，在最适pH值和培养温度条件下，120 r/min振荡培养7 d后，计算不同金属离子影响下椰糠降解率，测定CMCA与FPA。以未加金属离子的椰糠降解率和酶活力为100%作为对照。

1.3.5 测定方法

（1）CMCA和FPA测定参照文献[6-7]进行。

（2）椰糠降解率测定：椰糠液体培养基中接入5%菌种，30℃摇瓶培养。6 d后停止培养，过滤培养液，去离子水冲洗残留物5～6次。残留物80℃烘干至质量恒定，计算椰糠降解率[8]，其计算公式如下：

式中：M 1为对照组椰糠质量；M 2为降解后椰糠质量；M为初始椰糠质量。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

经梯度稀释的红树林土壤悬液，涂布于椰糠纤维菌筛选培养基上，长出的菌落挑取在真菌分离纯化培养基上反复划线纯化，得到9株菌株。分别将纯化后的菌株点种于CMC-Na培养基，经刚果红染色后测量透明圈直径（D）和菌落直径（d）的比值（D/d）大小。纯化的菌株接种于产酶培养基中，30℃、140 r/min摇床培养6 d，制得的粗酶液，测定CMCA与FPA，筛选结果见表2。

表2 纤维素降解菌株筛选结果Table 2 Screening results of cellulose-degrading strains

由表2可知，菌株DZ10的D/d值明显高于其他菌株，酶活也最高。因此以菌株DZ10作为后续研究对象。

2.2 菌株鉴定结果

菌株DZ10的形态特征见图1。由图1a可知，菌株DZ10菌落形态特征：菌丝呈现致密毛绒状，培养初期菌落白色，长浅绿色孢子，培养至7 d后反面变为黄绿色。由图1b可知，菌丝侧枝生出分生孢子梗，直且有分枝，孢子呈椭圆形。

图1 菌株DZ10的形态特征Fig.1 Morpho logical characteristics of strain DZ10

经Biolog生化系统分析，菌株DZ10利用较好的碳源有：L-谷氨酸、D-木糖、水杨苷、奎尼酸、D-甘露糖、D-核糖、2-酮-D-葡糖酸、L-岩藻糖、龙胆二糖、D-半乳糖、L-焦谷氨酸、B-环化糊精、甘油、L-阿拉伯糖、丙三醇、赤藻糖醇、L-鸟氨酸、D-山梨醇、葡萄糖胺等。

ITS的PCR扩增产物测序后提交GenBank获得菌株序列号为：MF062685，用BLAST进行同源性比对，并构建系统发育树如图2所示。

图2 菌株DZ10以ITS区为基础构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS o f strain DZ10

由图2可知，经形态学特征、Biolog自动分析系统结合ITS序列分析，鉴定菌株DZ10为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

2.3 椰糠降解特性研究

2.3.1 不同pH对菌株降解椰糠的影响

图3 不同pH值对菌株DZ10降解椰糠的影响Fig.3 Effects of different pH value on the coconut coir degradation of strain DZ10

由图3可知，pH值为6.5时，椰糠降解率达到最高值25.5%，CMCA达到最高值57.03U/m L，pH值为6.0时FPA达到最高值53.07U/m L。pH值为5.0～7.0时，椰糠降解率、CMCA和FPA均保持在较高值，说明菌株DZ10产纤维素酶降解椰糠纤维，适合于pH值弱酸条件。结果表明，菌株D210降解椰糠的最适pH值为6.5。

2.3.2 不同培养温度对菌株降解椰糠的影响

图4 不同培养温度对菌株DZ10降解椰糠的影响Fig.4 Effects of different culture tem perature on the coconut coir degradation of strain DZ10

由图4可知，当培养温度为35℃时椰糠降解率达到最高值27.3%，FPA达到最高值56.12U/m L，培养温度为40℃时CMCA达到最高值58.30U/m L。培养温度为30～40℃时椰糠降解率、CMCA和FPA均保持在较高值。结果表明，菌株D210降解椰糠的最适培养温度为35℃。

2.3.3 不同初始NaCl含量对菌株降解椰糠的影响

由图5可知，菌株DZ10表现出较好的耐盐性，当初始NaCl含量为0.5%～3.0%时，菌株生长良好，酶活力保持在较高水平。当初始NaCl含量为2.0%时椰糠降解率达到最高值31.4%，当初始NaCl含量为1.5%时，FPA达到最高值57.22 U/m L，初始NaCl含量为3.0%时CMCA达到最高值61.12 U/m L。结果表明，菌株D210降解椰糠的最适初始NaCl含量为6.5。

图5 不同初始NaCl含量对菌株DZ10降解椰糠的影响Fig.5 Effects of different initialNaCl concentration on the coconut coir degradation of strain DZ10

2.3.4 金属离子对菌株降解椰糠的影响

图6 金属离子对菌株DZ10降解椰糠的影响Fig.6 Effects ofmeta l ions on the coconut coir degradation of strain DZ10

由图6可知，Ca2+、K+对菌株DZ10产酶有促进作用且明显提高椰糠降解率，而Mg2+抑制菌株DZ10产酶或抑制酶活性，降低了椰糠降解率。其他离子对产酶和椰糠降解影响不显著。

3 结论

本研究从红树林土壤分离筛选出1株可用椰糠作为碳源，有较高产纤维素分解能力的菌株，编号为DZ10。经形态特征培养观察、生理生化分析和ITS分子序列特征比对，鉴定菌株DZ10为长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。海南东寨港红树林土壤属于典型的酸盐土壤，对纤维素菌酶活性特征有较大影响[9-10]，pH值为5.0～7.0时，CMCA和FPA均保持在较高值。金属离子对酶的影响，因不同环境分离到的不同菌种而情况各异[11-12]，Ca2+、K+对菌株DZ10酶活性有促进作用，而Mg2+抑制酶活性。结果显示，当pH值为6.5、培养温度为35℃、初始NaCl含量为2.0%、添加K+终浓度为0.1mmol/L时，椰糠降解率最高为39.88%。当pH值为6.5、培养温度40℃、初始NaCl含量3.0%、添加K+终浓度为0.1mmol/L时，CMCA最高值为80.07 U/m L。当pH值为6.0、培养温度35℃、初始NaCl含量1.5%、添加K+终浓度为0.1mmol/L，FPA最高值为73.81U/m L。

不同微生物所产纤维素酶的组分和性质各不相同，纤维素在多种纤维素酶的协同作用下被逐步降解，纤维素酶组成比例也影响纤维素降解效果[13-15]。长枝木霉DZ10菌株对椰糠纤维显示出较好的降解效果，可作为出发菌株进行改良研究，逐步用于生产。

[1]孙程旭，陈华，刘立云，等.椰子副产物的应用与发展[J].中国热带农业，2011（1）：45-47.

[2]郑侃，梁栋，张喜瑞.椰子废弃物综合利用现状与分析[J].广东农业科学，2013（5）：175-177.

[3]邓天福，杜开书，李广领.纤维素酶及其在酿造业中的应用[J].中国酿造，2011，30（12）：17-19.

[4]彦繁鹤，周金梅，吴如春.DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量[J].食品研究与开发，2015，36（2）：126-128.

[5]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科技出版社，1979：487.

[6]陈晶晶，王伏伟，刘曼，等.土壤中纤维素降解真菌的筛选及其纤维素酶活性的研究[J].安徽农业大学学报，2014，41（4）：654-661.

[7]罗奉奉，莫亚玲，刘鑫泰，等.纤维素酶产生菌YZB46的产酶条件研究[J].中国酿造，2016，35（11）：117-122.

[8]曾青兰.高活性纤维素酶菌株的筛选鉴定和秸秆降解特性的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.

[9]王小青，王健，陈雄庭.海南岛东寨港红树林盐土的理化性状[J].热带农业科学，2008，28（3）：32-37.

[10]王春燕，刘四新，高阳，等.红树林土壤纤维素酶产生菌筛选及产酶条件研究[J].食品与生物技术学报，2011，30（1）：144-150.

[11]邵娜娜，轩换玲，罗锋，等.一株产低温纤维素酶放线菌的分离与产酶研究[J].食品工业科技，2015，36（24）：159-168.

[12]付建红，任晓源，范秋霜，等.从天山花楸中从天山花楸中分离筛选纤维素酶产生菌及其酶学性质研究[J].食品科学，2012，33（23）：228-231.

[13]戴旭青，赵丰丽.一株广西红树林青霉属菌株纤维素酶的纯化及酶性质研究[J].中国酿造，2012，31（1）：111-125.

[14]AMANO Y,KANDA T.New insights into cellulose detradation by cellulosesand related enzymes[J].Trends Glycosci Glycotech,2002,14: 27-34.

[15]TOMMEP,WARREN RA,GILKESN R.Cellulosehydrolysisby bacteriaand fungi[J].Adv M icrobiol Physiol,1995,37(1):1-8.

Isolation,identification and characteristicsofa coconutcoir fiber-decomposing strain

LEIXianglan,SHEN Zhenguo,SUN Qian*,ZHENG Jinm ing
(DepartmentofTropical Agricultural Technology,Hainan College ofVocation and Technique,Haikou 570216,China)

Using the coconutcoirasa carbon source,ahigh cellulase-producing strain named DZ10was isolated from mangrove soils.Bymorphology identification,physiological and biochemical properties and molecular biological experiments,strain DZ10 was identified as Trichoderma longibrachiatum.Under the conditions of pH 6.5,culture temperature 35℃,initial NaCl concentration 2.0%and K+final concentration 0.1mmol/L,the coconutcoir degradation ratewas thehighestof 39.88%.Under the conditionsof pH 6.5,culture temperature 40℃,initial NaCl concentration 3.0% and K+final concentration 0.1mmol/L,the activity of carboxymethyl cellulase(CMCA)was the highestof 80.07U/m l.Under the conditionsof pH 6.0,culture temperature 35℃,initial NaCl concentration 1.5%and K+final concentration 0.1mmol/L,the activity of filter paper lyasewas the highestof 73.81 U/m l.Ca2+and K+promoted the enzyme production and the degradation rate of strain DZ10,butMg2+inhibited the enzyme production and the degradation rateof strain DZ10.

coconutcoir;cellulase;isolation;identification;degradation

TQ920.6

0254-5071（2017）08-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.016

2017-05-31

海南省自然科学基金项目（314094）；海南省教育厅科研基金项目（HNJG2014-85）

雷湘兰（1980-），女，讲师，硕士，研究方向为食品微生物、食品加工。

*通讯作者：孙倩（1982-），女，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。