吴翼 李静 杨耀东

摘要[目的]筛选可用的SSR分子标记，加快椰子分子辅助育种进程。[方法]采用改良CTAB法提取椰子基因组DNA，以基因组DNA为模板，对36对SSR引物进行筛选，以条带清晰、多态性丰富为引物筛选原则。[结果]共筛选出7对具有多态性的引物，其中2对多態性较丰富，可用于后续SSR分子标记分析。[结论]该研究为开展椰子种质资源遗传多样性系统分析提供了SSR引物。

关键词椰子；SSR；DNA提取；聚丙烯酰胺凝胶电泳

中图分类号S667.4文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）17-0119-03

Abstract[Objective]To accelerate the molecular assisted breeding process of coconut by screening SSR markers.[Method] The genomic DNA was extracted by modified CTAB method，and 36 SSR primers were screened with genomic DNA as template.[Result]A total of 7 pairs of polymorphic primers were screened，of which more than 2 pairs of polymorphism were found，which could be used for subsequent SSR molecular marker analysis.[Conclusion]The study provides the SSR primers for analysis of coconut germplasm genetic diversity system.

Key wordsCoconut；SSR；DNA extraction；PAGE Gel

基金項目海南省国际合作专项 （KJHZ2014-24）；农业部热带作物种质资源保护项目（16RZZY-104）。

作者简介吴翼（1980—），男，海南文昌人，助理研究员，硕士，从事热带油料作物分子生物学研究。*通讯作者，博士，研究员，从事热带油料作物分子生物学研究。

收稿日期2017-04-10

椰子（Cocos nucifera L.）是热带亚热带地区重要的木本油料作物和食品能源作物，具有投资少、管理简单、易生长、收获期长、经济寿命长、投资风险小、营养丰富、用途广泛等优点，深受人们的喜爱。椰子全身是宝，被称为热带地区的“生命之树”。但是椰子的生长周期较长，一般高种需要6～10年的营养生长，矮种也需要4～6年才能开花。而传统的育种手段太慢，且消耗大量的时间和人力。

分子标记辅助育种是一种可以有效缩短育种周期的重要手段，且分子标记技术从DNA水平上检测物种的差异，有效避免了形态标记和生化标记的缺点，它不受环境和生长阶段影响，仅在苗期就可以对植物进行评价。将分子标记应用于椰子育种中，是一种行之有效的育种手段。目前应用于椰子中的分子标记有很多种，例如RFLP、RAPD[1]、AFLP[2]、ISSR[3]等。SSR（simple sequence repeals）即简单重复序列[4-6]，又称为微卫星DNA，是近年来在PCR基础上发展起来的一种分子标记技术，是由少数核苷酸（一般1～6 bp）为重复单位簇集而成的串联重复序列，其在植物基因组中广泛分布、数量丰富、多态性高、信息含量大、重复性好、检测结果准确可靠，可在亲缘关系较近的品种间检测遗传差异，操作起来较灵活、简便、快速，易于分布，对DNA数量及质量要求不高，即使是部分降解的样品也可进行分析。SSR分子标记技术在植物遗传图谱构建、种质资源研究、基因定位、分子标记辅助选择、品种纯度鉴定及杂种优势利用等方面都得到了大量应用。椰子是椰子属唯一的一个种，各品种间的亲缘关系较近，目前可用于不同椰子品种间鉴定评价的SSR引物有限，远远不能满足椰子品种的快速鉴定和种质资源遗传关系的分析。该研究以5个海南常见的椰子品种共144份样品为材料，对36对SSR引物进行筛选，旨在获得多态性SSR引物，为今后开展椰子种质资源遗传多样性系统分析提供更多的SSR引物。

1材料与方法

1.1 材料

取中国热带农业科学院椰子研究所种质苗圃内收集的黄矮椰子、红矮椰子、本地高种、香水椰子、马哇5个椰子品种共144份样品的嫩叶为试验材料。

1.2试剂

（1）提取缓冲液：蔗糖119.8 g，1 mol/L Tris-HCl（pH 80）100 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）10 mL，PVP40 20 g，β-巯基乙醇（使用前加）30 mL，用DDH2O定容至1 000 mL，4 ℃保存。

（2）裂解液：1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）100 mL，NaCl 818 g，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）40 mL，CTAB 20 g，PVP40 20 g，β-巯基乙醇（使用前加）30 mL，用DDH2O定容至1 000 mL，4 ℃保存。

（3）TE缓冲液：1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）1 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）0.2 mL，用DDH2O定容至100 mL，4 ℃保存。

（4）1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）200 mL：Tris碱24.2 g，加160 mL DDH2O溶解，用浓HCl（约8 mL）调pH8.0。

（5）0.5 mol/L EDTA（pH8.0）100 mL：EDTA二钠18.6 g，加80 mL DDH2O溶解，用NaOH（约2 g）调pH8.0，定容至100 mL，高压灭菌后4 ℃保存。

（6）3 mol/L乙酸钠（pH5.2）100 mL：三水合乙酸钠40.8 g，加80 mL DDH2O溶解，用冰乙酸调pH 5.0，定容至100 mL，高压灭菌后4 ℃保存。

（7）50×TAE缓冲液：Tris碱242.0 g，冰乙酸57.1 g，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）100 mL，用DDH2O定容至1 000 mL。

（8）6×电泳缓冲液：溴酚蓝0.125 g，蔗糖20 g，用DDH2O定容至50 mL，4 ℃保存。

（9）5×TBE 缓冲液（1 000 mL）：Tris碱54.0 g，硼酸27.5 g，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，用DDH2O定容至1 000 mL。

（10）1×TBE 缓冲液：5×TBE 缓冲液 200 mL，用DDH2O稀释5倍至总体积1 000 mL。

（11）10%AP（50 mL）：过硫酸铵5 g，用DDH2O加至50 mL，搅拌溶解充分后，4 ℃保存。

（12）脱色液：50 mL乙酸，300 mL乙醇，定容至1 000 mL。

（13）保存液：5%～7%的乙酸。

（14）30%（29∶1）Acrylamide贮存液（500 mL）：Acrylamide 145 g，BisAcrylamide 5 g，用DDH2O定容至500 mL，过滤后于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3方法

1.3.1DNA提取。称取1.2 g叶片，液氮磨成粉状加入6 mL DNA提取缓冲液后转至10 mL离心管中，8 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清，加入5 mL预热至65 ℃ 的DNA裂解缓冲液水浴90 min，每20 min摇匀1次；8 000 r/min，15 ℃离心10 min，取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），上下摇匀后8 000 r/min，4 ℃离心10 min；取上清，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），摇匀，8 000 r/min，4 ℃离心10 min；取上清，加入1/10体积的3 mol/L乙酸钠（pH5.2）和6/10体积冰冻异丙醇，缓慢摇匀至有絮状沉淀析出；8 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃去液体，加入1 mL75%乙醇，振荡，迅速倒入1 mL离心管，置于冰中；将已提取好的DNA用75%乙醇洗2次，室温放置干燥，加入200 μLTE溶液溶解，置于4 ℃保存。

1.3.2DNA质量检测。

1.3.2.1琼脂糖检测。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA：取2 μLDNA工作液于120 V，电泳30 min后在凝胶成像仪上观察电泳条带。

1.3.2.2核酸微量检测。

取1 μL DNA在Nandrop仪（Thermo 公司）上测定其在230、260和280 nm下的吸光度值，计算OD260/OD280及OD260/OD230。

1.3.3SSR引物筛选。

1.3.3.1PCR扩增体系及程序。PCR 扩增反应体系的总体积为20 μL，其中10×Ex Taq Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.6 μL，4×DNTP Mixture 0.5 μL，10 μmol/L Primer各1 μL，基因组DNA 2 μL，5 U/μL Taq DNA polymerse 0.2 μL，加无菌DDH2O至20 μL，混匀后4 500 r/min，离心10 s。在TP1600梯度PCR仪上进行反应。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min。

1.3.3.28%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备。H2O 15.81 mL，5×TBE 6 mL，30%（29∶1）贮存液7.98 mL，10%AP（过硫酸铵）0.21 mL，TEMED 0.015 mL，将以上溶液混合，匀速灌入聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的2块电泳玻璃板之间的缝隙中，放置3～5 h凝胶后备用。

1.3.3.3銀染方法。漂洗，用蒸馏水漂洗2遍；银染，配制银染液（AgNO3 1 g，无水乙醇50 mL，10%乙酸50 mL，蒸馏水 400 mL），在摇床上摇12 min，洗2遍，约30 s；显影，配制显影液（NaNO3 9 g ，甲醛3 mL，蒸馏水600 mL），在摇床上摇至条带显出，洗3遍；终止，Na2CO3 4.5 g，蒸馏水 600 mL，暂时保存，在扫描仪上进行扫描，拍照，观察。

1.3.3.4特异性引物筛选。

分别从5个不同椰子品种中随机选取6个样本作为PCR扩增的DNA模板，对36对SSR引物进行初筛，筛选出具有多态性的引物，再以5个品种共144份样品的基因组DNA为模板，对其进行复筛。

2结果与分析

2.1DNA提取结果

由表1可以看出，5个椰子品种共144个样品的DNA质量均较高。5个品种的DNA样本OD260/OD280在1.98～2.02，OD260/OD230在1.86～2.00，估计有少量RNA污染，但是不影响后续的试验。琼脂糖电泳检测见图1，电泳结果表明DNA条带清晰，无弥散，不拖尾，点样孔干净，无蛋白和RNA污染，说明DNA质量较好。

2.2SSR引物筛选结果

选用5个椰子品种共30个样品的DNA 作模板， 对该试验中合成的36对SSR引物进行筛选，大部分引物能扩增出清晰条带，该研究以条带清晰、多态性丰富为引物筛选原则， 36对引物中共筛选出7对具有多态性的引物，多态率达19.4%，具体序列见表2。再以5个椰子品种共144个样品的基因組DNA为模板，对具有多态性的7对SSR引物进行复筛，最后发现有2对SSR引物（HAYZ-D-QH-5506 和HAYZ-D-ZH-5506）多态性高且重复性好，可用于后续的遗传多样性分析，电泳结果见图2、图3。

3討论

近年来，随着分子生物学技术的发展，分子标记越来越广泛地应用于各种作物的遗传和育种研究中；利用SSR 标记的高多态性，结合相关分析、聚类分析等数量遗传分析手段，可以对不同亲缘物种进行分类，判断其亲缘关系，评价不同品种的异质性，并进而划分杂交优势群；筛选出扩增性强、多态性和稳定性好的引物是进行全部基因组扩增成败的关键，尤其是种内的扩增，因为种内的个体除自然变异外，其基因型没有太多的差异，所以没有多态性强、稳定性好的引物很难区别个体内的差异。SSR引物筛选是SSR分子标记的前提，该研究以5个不同椰子品种的基因组DNA作模板，对36对SSR引物进行筛选，由于种内品种间遗传关系较近，扩增到的特异位点较少，36对SSR引物共筛选到7对具有多态性的引物，为确保后续SSR分析的可靠性，进一步复筛，最后得到条带清晰、多态性明显的引物仅2对，这显然不够，今后还应继续筛选更多的SSR引物，用于椰子品种间遗传多样性的分析。

参考文献

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