鲍 雷,肖 杨,蔡夏夏,王 楠,李 勇(.北京大学国际医院营养科,北京 006; .北京大学医学部公共卫生学院营养与食品卫生学系,北京 009)



5′-核苷酸对慢性酒精中毒诱导大鼠结肠功能损伤的影响

鲍 雷1,肖 杨1,蔡夏夏2,王 楠2,李 勇2
(1.北京大学国际医院营养科,北京 102206; 2.北京大学医学部公共卫生学院营养与食品卫生学系,北京 100191)

探讨外源性5′-核苷酸对酒精诱导大鼠结肠功能紊乱的保护作用。50只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、酒精模型组、等热量对照组及0.04%、0.16%核苷酸组。连续酒精灌胃6周后,结果发现,外源性5′-核苷酸能够有效改善酒精引起的大鼠结肠病理性改变,显著提高结肠功能相关蛋白Claudin和Occludin的表达水平(p<0.01或p<0.05),极显著降低大鼠结肠组织中Toll样受体4(TLR4)和分化抗原簇14(CD14)的表达水平(p<0.01);外源性5′-核苷酸能够显著增加大鼠回肠内容物中双歧杆菌(酒精组8.00 log CFU/g,核苷酸组8.32 log CFU/g)和乳酸杆菌数量(酒精组7.44 log CFU/g,核苷酸组8.13 log CFU/g)(p<0.05),同时显著减少肠球菌(酒精组7.52 log CFU/g,核苷酸组7.03 log CFU/g)及大肠杆菌数量(酒精组6.85 log CFU/g,核苷酸组6.19 log CFU/g)(p<0.05)。因此,外源性5′-核苷酸能够通过调节肠道菌群改善酒精引起的大鼠结肠损伤。

5′-核苷酸,结肠功能,肠道菌群

近年来,酒精摄入引起相关的健康问题逐渐受到人们的重视。2005年世界卫生组织(WHO)明确指出,在全球范围内酒精导致4%的患病率和3.2%的死亡率,如酒精性肝病、慢性胰腺炎、胃炎、出血性卒中、高血压、心脏病以及恶性肿瘤等[1]。长期过量饮酒或饮用高度酒均会对健康产生一定的不良影响,严重时可导致脂肪肝、肝硬变并损伤中枢神经系统及心脏功能。目前关于酒精所致疾病的研究主要集中于酒精性肝病,但酒精性肝病的发病过程中伴随着肠道屏障功能的变化[2]。酒精摄入可增加机体小肠黏膜通透性,引发肠道屏障功能障碍,促使肠源性内毒素渗漏形成肠源性内毒素血症,从而进一步加重肝脏损伤[3]。此外,有实验证实酒精对人和实验动物的胃肠道运动均有一定的抑制作用,长期饮用可引起胃肠道粘膜表面发生病理性变化[4-7]。

近年来有研究发现肠道菌群在维持肠道屏障功能方面有重要作用,并且与酒精所致疾病密切相关[8]。核苷酸是由核苷与磷酸通过酯键结合构成的生物分子,尽管核糖上的游离羟基(核糖的C-2′,C-3′,C-5′及脱氧核糖的C-3′,C-5′)均能与磷酸发生酯化反应,但生物体内多数核苷酸的酯化反应都是在C-5′原子上,都是属于5′-核苷酸。5′-核苷酸具有多种生物学作用,如免疫调节作用,延缓衰老作用,抑制肿瘤,保护肝脏,并对胃肠道的生长、修复和分化有重要作用[9]。研究发现,5′-核苷酸能够改善配方食品组婴幼儿肠道菌群的组成,促进双歧杆菌的生长,直接抑制拟杆菌属-卟啉单胞菌属-普氏菌属的生长,因此,核苷酸补充具有直接的益生菌效应[10]。目前有关核苷酸对酒精引起的结肠功能变化的相关研究未见报道。因此,本研究通过动物实验观察酒精对实验大鼠结肠功能的影响,并探讨外源性5′-核苷酸的保护作用,为5′-核苷酸应用于酒精性结肠损伤的预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

5′-核苷酸混合物(纯度99%,5′AMP∶5′CMP∶5′GMPNa2∶5′UMPNa2=22.8-26.6-20.4-30.2) 大连珍奥生物工程股份有限公司;基础饲料 美国营养学会(American Institute of Nutrition,AIN-93G)纯化饲料;添加核苷酸饲料配方 在AIN-93G纯化饲料基础上分别以0.4 g/kg和1.6 g/kg的比例添加核苷酸,北京华阜康生物科技股份有限公司;右旋糖(纯度≥99.5%) 美国Sigma公司;抗闭合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)、TLR4、CD14、β-actin抗体 美国Santa Cruz公司;聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜 美国Millipore公司;BD Difco脱脂奶粉skim milk 上海力敏实业有限公司;IgG辣根过氧化物酶标记二抗 北京中杉金桥生物技术有限公司;RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒 北京碧云天生物技术有限公司;ECL显色试剂盒 北京普利莱基因技术有限公司;微生物培养基 青岛海博生物技术有限公司。

Eppendorf Centrifuge 5804R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;AdventurerTM通用型分析天平 美国OHAUS公司;Biorad550型酶联免疫检测仪 美国BioTek公司;尼康E100生物显微镜 日本尼康公司;IKAMS2型振荡器 德国 IKA公司;TYZD-II型水平摇床 上海精密科学仪器有限公司;Bio-rad垂直平板电泳槽 美国 Bio-Rad公司;DYCZ-30B垂直电泳仪 北京六一仪器厂;WDD-1发光测试仪 北京第二光学仪器厂;BCD-260WDGQ型低温冰箱 海尔集团;MDF-C8V1超低温冰箱 日本三洋公司;HH-2电热恒温水浴箱 上海跃进医疗器械厂。

1.2 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠,9周龄,300～350 g,由北京大学医学部实验动物中心提供(实验动物生产许可证号:SCXK(京)2011-0012)。实验动物分笼饲养,每笼3只,自由饮食、饮水。动物饲养在北京大学医学部实验动物科学部,动物实验环境为SPF级,温度范围(22±1) ℃,相对湿度40%～50%,室内照明控制在12 h/12 h光暗周期节律。

1.3 实验动物分组及处理

雄性SPF级Wistar大鼠50只,适应性喂养2周,按体重随机分为正常对照组(Normal control group)、酒精模型组(Alcohol control group)、等热量对照组(Dextrose control group)、0.04%和0.16%核苷酸(NTs)干预组,每组10只,除正常对照组和等热量对照组外,其余30只大鼠使用50%酒精(v/v)灌胃,为提高大鼠对酒精的适应性,酒精初始灌胃量为每天2 g/kg·bw,随后每天增加0.5 g/kg·bw,2周后灌胃剂量达到并稳定在8 g/kg·bw,此为维持剂量,之后每天灌胃2次(灌胃时间为8:00 a.m.和3:00 p.m.),每次灌胃酒精4 g/kg·bw,继续干预4周,干预第6周末用代谢笼准确量取各组大鼠进食量。正常对照组每天灌胃等体积的蒸馏水,等热量对照组每天灌胃与酒精模型组热量相等的右旋糖溶液(0.875 g/mL)。正常对照组、酒精模型组和等热量对照组大鼠给予AIN-93G饲料喂养,0.04%和0.16%核苷酸干预组是在AIN-93G饲料基础上每千克分别添加0.4 g和1.6 g核苷酸所制成。

1.4 结肠组织切片形态学观察

大鼠处死后,迅速分离横结肠中段1～2 cm,置于4%多聚甲醛溶液中固定,常规制作石蜡切片,采用苏木精-伊红(HE)染色,使用光学显微镜进行形态学观察。

1.5 Western Blotting检测蛋白表达

取0.1 g结肠组织,加入冰预冷的RIPA裂解液,置于冰上并用玻璃匀浆器充分匀浆至完全裂解,4 ℃,12000 r/min,离心5 min后吸取上清液。采用2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法进行蛋白定量。样品经SDS-PAGE电泳,湿转法转膜2 h后转至PVDF膜上。PVDF膜用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h后,分别将抗闭合蛋白(Claudin)(1∶200)、咬合蛋白(Occludin)(1∶200)、Toll样受体4(TLR4)(1∶200)、分化抗原簇14(CD14)(1∶200)和β-actin(1∶1000)抗体用5%牛血清白蛋白稀释,4℃孵育过夜。洗膜后以辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶4000)于37 ℃恒温箱中孵育1 h。采用增强化学发光法进行成像,WDD-1发光测试仪检测。β-actin作为内参,利用Image Pro-plus 6.0软件(Media Cybernetics,Inc.)进行灰度分析[11]。

1.6 肠道菌群培养

按照培养基说明配制所需培养基,处死大鼠后,迅速取大鼠结肠内容物0.1 g,加入10 mL无菌生理盐水中,充分振荡混匀,再稀释到所需浓度。双歧杆菌采用10-4、10-5和10-6三个稀释度,滴种2 μL标本液于培养基上;乳酸杆菌采用10-3、10-4和10-5三个稀释度,点样体积2 μL;大肠杆菌、肠球菌均采用10-4和10-5两个浓度,点样体积5 μL。

表1 各组大鼠24 h进食量Table 1 The food intake of rats for 24 h

图1 各组大鼠结肠组织病理学结构变化(400×)Fig.1 The pathological structure change in colon of rats(400×)注:A:正常对照组;B:酒精模型组;C:等热量对照组;D:0.04%核苷酸组;E:0.16%核苷酸组;图2、图4同。

双歧杆菌、乳酸杆菌置于37 ℃恒温厌氧罐内倒置培养48 h,大肠杆菌及肠球菌置于37 ℃生化培养箱内倒置培养24 h。培养结束后,观察并记录每克结肠内容物的菌落数量,结果表示为lg CFU/g。

1.7 统计方法

所有实验数据均以x±s表示。采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析,p<0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 各组大鼠24 h进食量

如表1所示,各组大鼠24 h进食量没有显著性差异(p>0.05)。

2.2 各组大鼠结肠组织病理学结构变化

如图1(A和C)所示,正常对照组和等热量对照组大鼠肠道结构完整,粘膜层、固有层、粘膜下层和肌层清晰可见,粘膜层和固有层杯状细胞丰富、肠腺发达、排列规则;酒精模型组大鼠结肠粘膜不完整,杯状细胞减少,可见潘氏细胞,粘膜下层可见炎性细胞浸润,肌层不完整(图1B);与酒精模型组相比,核苷酸干预组大鼠结肠粘膜较为完整,炎性细胞减少,肌层较完整(见图1D和E),表明核苷酸可有效改善酒精引起的大鼠结肠组织病理性结构变化。

2.3 各组大鼠结肠功能相关蛋白Claudin和Occludin的表达变化

Claudin和Occludin是细胞间转运过程中构成紧密连接的主要跨膜蛋白,在肠道屏障功能发挥中扮演着重要角色。如图2及图3所示,与等热量对照组相比,酒精模型组大鼠结肠组织中Claudin和Occludin的表达均显著降低(p<0.01),说明酒精能够破坏结肠上皮细胞间紧密连接,影响其结构和功能,在一定程度上增加了结肠通透性;与酒精模型组相比,5′-核苷酸干预能够显著上调结肠组织中Occludin和Claudin的蛋白表达水平(p<0.01或p<0.05),且呈剂量依赖关系,表明核苷酸干预可以有效提高大鼠结肠组织中Claudin和Occludin的表达水平,从而改善酒精引起的结肠结构和功能损伤。

图2 各组大鼠结肠功能相关蛋白电泳图Fig.2 The electrophoretogram of colon function related protein in rats

图3 各组大鼠结肠功能相关蛋白表达的变化Fig.3 The expression of colon function related protein in rats.注:与等热量对照组相比,*p<0.05,**p<0.01; 与酒精模型组相比,#p<0.05,##p<0.01;图5、表1同。

表2 各组大鼠回肠内容物双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌及大肠杆菌变化Table 2 Changes of Bifidobacterium,Lactobacillus,Enterococcus,E. coli in ileum contents of rats(±s,n=10)

2.4 各组大鼠结肠组织中TLR4和CD14的表达变化

如图4及图5所示,与等热量对照组相比,酒精模型组大鼠结肠组织中TLR4和CD14蛋白表达水平显著增高(p<0.01);而与酒精模型组相比,膳食中添加0.04%和0.16%核苷酸组能够极显著抑制酒精引起的大鼠结肠组织中TLR4和CD14蛋白表达水平的升高(p<0.01)。

图4 各组大鼠结肠组织中TLR4和CD14蛋白电泳图Fig.4 The electrophoretogram of TLR4 and CD14 in colon of rats

图5 各组大鼠结肠组织中TLR4和CD14的表达变化Fig.5 The protein expression levels of TLR4 and CD14 in colon of rats

TLR4和CD14为LPS/LPS结合蛋白(LPS-binding protein,LBP)复合物受体,可介导LPS引起的炎症反应[12]。Hritz等[13]研究发现,酒精摄入会导致野生型小鼠TLR4、CD14及炎症因子水平明显升高。人群研究也发现酗酒者体内内毒素和CD14水平明显高于健康者[14]。本实验中发现了类似的结果,酒精模型组大鼠结肠组织中TLR4和CD14的表达水平显著增高(p<0.01),推测其原因可能是酒精引起的肠道菌群紊乱导致有害菌大量增长,通过结肠上皮进入血液,出现内毒素血症。而外源性5′-核苷酸能够极显著降低大鼠结肠组织中TLR4和CD14的表达水平(p<0.01),说明核苷酸能够促进肠道菌群结构的改善,进而缓解内毒素血症所致的结肠结构和功能障碍,这可能是核苷酸发挥结肠保护作用的机制之一。

2.5 各组大鼠回肠内容物中肠道菌群变化

如表2所示,与等热量对照组相比,酒精模型组大鼠回肠内容物中双歧杆菌减和乳酸杆菌均显著减少(p<0.05),而肠球菌及大肠杆菌数量显著增多(p<0.05)。与酒精模型组相比,0.04%和0.16%核苷酸组大鼠回肠内容物中双歧杆菌和乳酸杆菌数量显著增多(p<0.05);同时0.04%和0.16%核苷酸组大鼠回肠内容物中肠球菌及大肠杆菌数量较酒精模型组显著减少(p<0.05)。

研究证实,肠道菌群与宿主的各种生理功能息息相关,直接参与机体的消化、吸收、能量代谢和免疫调节等生理活动[15-17]。肠道菌群紊乱也会引胃肠道疾病(结肠癌、非炎症性肠病)及慢性非传染性疾病(肥胖、糖尿病等)等疾病的发生[18-19]。在肠道菌群中,拟杆菌门和厚壁菌门占主要地位,二者大约占微生物总量的90%,正常情况下,这些肠道微生物处于动态平衡状态[20]。然而,过量摄入酒精可导致肠道菌群结构发生失衡,乳杆菌、双歧杆菌、多形杆状菌等主要产短链脂肪酸菌属数量大幅下降,使得短链脂肪酸产生减少,造成肠粘膜营养不足,还可减少与肠上皮细胞增殖和分化密切相关的GLP-2表达,进而会抑制肠上皮紧密连接蛋白-1(ZO-1)和Occludin蛋白的表达,使肠道的屏障功能受损,肠道的通透性增加,促进大量脂多糖(LPS)由肠道入血;另一方面,酒精可促进肠球菌和大肠杆菌等的繁殖,LPS大量增加,导致内毒素血症,引起严重炎症反应[21]。本实验结果表明,酒精模型组大鼠回肠内容物中有益菌群双歧杆菌和乳酸杆菌较等热量对照组显著降低(p<0.05),而肠球菌及革兰氏阴性菌大肠杆菌显著增多(p<0.05),表明酒精可引起大鼠回肠内肠道菌群紊乱;核苷酸干预能够改善酒精引发的大鼠肠道菌群紊乱,这与早期报道相一致[22]。

3 结论

采用50%乙醇灌胃,成功诱导大鼠结肠功能损伤,实验结果初步证明膳食添加核苷酸能够有效减轻酒精引起的结肠结构损伤,显著提高结肠功能相关蛋白Claudin和Occludin的表达,其作用机制可能与核苷酸能够有效调节肠道菌群,显著降低LPS介导受体TLR4和CD14的表达水平有关。本研究为5′-核苷酸应用于酒精性结肠损伤的临床营养治疗提供了实践证明和理论依据。但其保护作用的具体调节通路及最佳摄入量仍有待进一步探究。

[1]Anon. Public health problems caused by harmful use of alcohol-report by the Secretariat[J]. European Journal of Public Health,2005,20(2):128-129.

[2]白顺滟,彭燕. 酒精性肝病与肠道屏障功能改变及谷氨酰胺的保护作用观察[J]. 实用肝脏病杂志,2006,9(3):178-181.

[3]Keshavarzian A,Holmes EW,Patel M,et al. Leaky gut in alcoholic cirrhosis-a possible mechanism for alcohol-induced liver damage[J]. Am J Gastroenterol,1999,94(1):200-207.

[4]Rothwarf DM,Zandi E,Natoli G,et al. IKK-γis an essential regulatory subunit of the IκB kinase complex[J]. Nature,1998,395(6699):297-300.

[5]段相林,李健,张健,等. 不同浓度酒精对小鼠胃肠道粘膜的影响[J]. 电子显微学报,2001,20(4):487-488.

[6]Rubbens J,Brouwers J,Wolfs K,et al. Ethanol concentrations in the human gastrointestinal tract after intake of alcoholic beverages[J]. Eur J Pharm Sci,2016,86:91-95.

[7]Wang SL,Xie DP,Liu KJ,et al. Nitric oxide mediates the inhibitory effect of ethanol on the motility of isolated longitudinal muscle of proximal colon in rats[J]. Neurogastroenterol Motil,2007,19(6):515-521.

[8]蔡夏夏,鲍雷,王楠,等. 膳食5′-核苷酸对酒精性肝损伤大鼠肠道菌群的影响[J]. 食品科学,2015,36(15):212-216.

[9]Holen E,Bjørge OA,Jonsson R. Dietary nucleotides and human immune cells. II. Modulation of PBMC growth and cytokine secretion[J]. Nutrition,2006,22(1):90-96.

[10]Gil A. Modulation of the immune response mediated by dietary nucleotides[J]. Eur J Clin Nutr,2002,56(Suppl.3):S1-S4.

[11]Cai X,Bao L,Wang N,Ren J,et al. Dietary nucleotides protect against alcoholic liver injury by attenuating inflammation and regulating gut microbiota in rats[J]. Food Funct,2016,7(6):2898-2908.

[12]Leclercq S,Matamoros S,Cani PD,et al. Intestinal permeability,gut-bacterial dysbiosis,and behavioral markers of alcohol-dependence severity[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(42):E4485-4493.

[13]Hritz I,Mandrekar P,Velayudham A,et al. The critical role of toll-like receptor(TLR)4 in alcoholic liver disease is independent of the common TLR adapter MyD88[J]. Hepatology,2008,48(4):1224-1231.

[14]Schäfer C,Parlesak A,Schütt C,et al. Concentrations of lipopolysaccharide-binding protein,bactericidal/permeability-increasing protein,soluble CD14 and plasma lipids in relation to endotoxaemia in patients with alcoholic liver disease[J]. Alcohol Alcohol,2002,37(1):81-86.

[15]Guarner F,Malagelada JR. Gut flora in health and disease[J]. Lancet,2003,361(9356):512-519.

[16]Xu J,Bjursell MK,Himrod J,et al. A genomic view of the human-Bacteroides thetaiotaomicron symbiosis[J]. Science,2003,299(5615):2074-2076.

[17]Bäckhed F,Ding H,Wang T,et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(44):15718-15723.

[18]Pryde SE,Duncan SH,Hold GL,et al. The microbiology of butyrate formation in the human colon[J]. FEMS Microbiol Lett,2002,217(2):133-139.

[19]Seksik P,Rigottier-Gois L,Gramet G,et al. Alterations of the dominant faecal bacterial groups in patients with Crohn’s disease of the colon[J]. Gut,2003,52(2):237-242.

[20]Dumas ME,Barton RH,Toye A,et al. Metabolic profiling reveals a contribution of gut microbiota to fatty liver phenotype in insulin-resistant mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(33):12511-12516.

[21]McClain CJ,Barve S,Deaciuc I,et al. Cytokines in alcoholic liver disease[J]. Semin Liver Dis,1999,19(2):205-219.

[22]Singhal A,Macfarlane G,Macfarlane S,et al. Dietary nucleotides and fecal microbiota in formula-fed infants-a randomized controlled trial[J]. Am J Clin Nutr,2008,87(6):1785-1792.

Effects of 5′-nucleotides on the injury of colon function induced by chronic alcoholism in rats

BAO Lei1,XIAO Yang1,CAI Xia-xia2,WANG Nan2,LI Yong2

(1.Department of Nutrition and Dietetics,Peking University International Hospital,Beijing 102206,China; 2.Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Peking University,Beijing 100191,China)

The aim of this study was to investigate the protective effects of exogenous 5′-nucleotides on alcohol induced colon function injury in SD rats. Fifty SPF male Wistar rats were randomly divided into normal control group,alcohol model group,dextrose control group,0.04% and 0.16% nucleotides intervention group. After continuous ethanol lavage for 6 weeks,the results showed that exogenous 5′-nucleotides could effectively improve the pathological changes of colon in rats induced by alcohol,increase the expression levels of Claudin and Occludin and reduce the levels of TLR4 and CD14 in colon tissues(p<0.01). The numbers ofBifidobacterium(8.32 vs. 8.00 log CFU/g)andLactobacillus(8.13 vs. 7.44 log CFU/g)in ileum contents were significantly decreased,and the numbers ofEnterococcus(7.03 vs. 7.52 log CFU/g)andE.coli(6.19 vs. 6.85 log CFU/g)were significantly decreased in nucleotides intervention groups when compared with the alcohol model group(p<0.05). Therefore,exogenous 5′-nucleotides could improve the alcohol induced colon function injury in rats which may attribute to the regulation of gut microbiota.

5′-nucleotides;colon function;gut microbiota

2016-11-28

鲍雷(1984-),男,博士,主管技师,研究方向:营养与疾病,E-mail:baolei6230@163.com。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.059