罗 敏,陈德经,苏 文(.陕西理工大学,生物科学与工程学院,陕西汉中 72300; 2.陕西理工大学,陕西省资源生物重点实验室,陕西汉中 72300)



大米胚芽锌多糖制备及其抗氧化活性

罗 敏1,陈德经2,*,苏 文1
(1.陕西理工大学,生物科学与工程学院,陕西汉中 723001; 2.陕西理工大学,陕西省资源生物重点实验室,陕西汉中 723001)

采用超声辅助提取大米胚芽多糖,并以多糖和硫酸锌为原料制备大米胚芽锌多糖络合物并研究其活性。结果表明，大米胚芽锌多糖适宜的制备工艺条件为:多糖与硫酸锌质量比(1.000∶0.800)、溶液pH为6.0、反应温度65 ℃、反应时间2.5 h。在此条件下,所制备的锌多糖配合物中锌元素含量为(5.617±0.279) mg/g。此外大米胚芽多糖、大米胚芽锌多糖对DPPH自由基清除率为57.76%、62.15%;对超氧阴离子自由基的清除率为60.11%、67.44%;对羟自由基清除率为56.94%、61.89%;对还原力随浓度的增加而增强。可见,大米胚芽锌多糖比大米胚芽多糖的抗氧化活性更强。

大米胚芽,多糖,锌多糖,抗氧化活性

米胚是稻谷加工大米的副产物,约占稻谷总质量的2%至2.2%[1],是整个稻谷籽粒中的精华,并具有显著的营养价值。米胚中营养成分含量丰富,蛋白质和脂类的含量分别为22.25%和26.44%,多糖的含量高达27.31%[2]。近年来研究发现,多糖具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫力、降血糖、抗糖尿病等功效[3-4]。

锌是人体中必须的微量元素之一[5]。成年人组织中总锌含量为2～2.5 g,我国成年人锌的推荐量为11～12 mg,至少有85种酶是含锌的金属酶,因此锌几乎与所有水平上的蛋白质和氨基酸代谢有关[6]。锌还具有与巯基的亲和力,而巯基是决定蛋白质结构(例如酶、膜)的重要因素。锌起着特殊作用的酶包括乙醇脱氢酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脱羧酶等。鉴于锌参与生物体系几乎所有的代谢,包括遗传物质的转录和复制,因此,锌缺乏症状是非特异性的,可能有许多病症同时出现[7]。锌可增强儿童生长发育,提高人体免疫力,预防疾病等[8]。人体获得锌主要依赖于食物,常见的补锌制剂多为无机锌,不仅不利于吸收,剂量过多时对人体有毒害作用[9]。随着科学研究进展,发现有机锌可增强生物吸收及利用,因此有机锌化合物的合成成为科研人员的研究热点。目前合成的多糖锌有蛹虫草基质多糖锌[7]、酵母多糖锌、金针菇多糖锌[10-11]等,其采用的合成方法主要有食用菌液体发酵富集锌,人工合成法[12-13]。国内外研究报道锌多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖等生物活性[14-15],而对米胚锌多糖的制备及活性尚未研究报道。

本实验利用多糖与硫酸锌制备出一种补锌保健产品,并研究其体外抗氧化活性,意在开发具有不同的新型多糖与微量元素螯合物的研究奠定理论基础,同时增加大米胚芽多糖的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大米胚芽 勉县定军米业发展有限责任公司(籼米);石油醚、正丁醇、蒽酮、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯化铁、三氯乙酸等 均为分析纯;优级纯硝酸、锌标准溶液(1.000 mg/mL) 天津市光复精细化工研究所。

DK-98-Ⅱ型恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;JA5003型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;LC-800型低速台式离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司;DZF-6050型真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;SB-3200型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;RV10型基本型数显型旋转蒸发仪 广州仪科实验室技术有限公司;UV-1750型紫外可见分光光度仪 日本岛津仪器公司;Thermo SOLAAR MKII M6原子吸收分光光度计 Thermo Electron corporation。

1.2 实验方法

1.2.1 大米胚芽多糖的提取 取一定质量干燥的大米胚芽,加3倍体积的石油醚溶液在70 ℃下回流脱脂3 h,冷却后3800 r/min离心10 min,取残渣于60 ℃恒温鼓风干燥箱中烘干。称取脱脂后烘干的大米胚芽200 g,加入2000 mL蒸馏水,65 ℃水浴提取3 h,80 W超声波10 min,冷却至室温离心(3800 r/min,10 min),取上清液,残渣用蒸馏水再浸提2次,合并3次上清液,浓缩上清液至原体积的1/3后加入3倍体积的Sevage溶液(氯仿∶正丁醇=3∶1),剧烈振摇15 min,离心(3800 r/min,10 min),取上清液,弃去变性蛋白,将上清液重复除变性蛋白的操作,直至中间层无变性蛋白。向上清液中加入95%乙醇,乙醇的最终体积分数为85%,冰箱冷藏,静置12 h后,3800 r/min离心10 min,沉淀用乙醇丙酮洗涤3次,50 ℃真空干燥24 h(0.08 mPa),得大米胚芽粗多糖[16]。多糖的提取率公式为:

式中:A为干燥后多糖的质量(g);B为脱脂的大米胚芽质量(g);K为多糖提取率(%)。

1.2.2 去除阳离子大米胚芽多糖 采用戴强[17]的方法预处理好阳离子树脂,将浸泡好的凝胶缓慢匀速倒入柱中以防止气泡产生,自然沉降,取上述制得的多糖溶解成1%的多糖溶液,溶液上柱,上样量为600 mm×55 mm柱体积的20%,控制流速为1.0 mL/min。用去离子水洗脱,洗脱液浓缩至原体积的1/3后,加入95%乙醇,乙醇的最终体积分数为85%,之后离心、干燥与1.2.1步骤相同,得去除阳离子大米胚芽多糖。

1.2.3 多糖含量测定 用硫酸-蒽酮法测定大米胚芽粗多糖中多糖含量。

1.2.3.1 葡萄糖标准曲线的建立 准确称取0.1000 g分析纯葡萄糖(预先在105 ℃干燥至恒重),配制成溶液浓度分别为10、30、50、70、90 μg/mL葡萄糖标准液。分别取不同浓度的葡萄糖标准液2 mL于试管中,以蒸馏水作空白,分别加入8 mL硫酸蒽酮溶液(2 mg/mL),迅速浸入冰水浴中,放置在100 ℃沸水浴中10 min取出,流法水冷却,在625 nm处测定吸光度[18],以吸光度值(Y)为纵坐标,葡萄糖浓度(X,μg/mL)为横坐标,绘制标准曲线图,其标准曲线方程为:Y=0.0056X+0.0412,R2=0.9989。

1.2.3.2 样品的测定 准确移取配制50 μg/mL米胚多糖溶液2 mL,按1.2.3.1方法显色,测其吸光度,并计算样品多糖的含量。

1.2.4 大米胚芽锌多糖的制备 称取1.000 g的大米胚芽多糖溶于150 mL去离子水中,配制成大米胚芽粉多糖溶液,缓慢加入0.800 g的ZnSO4·7H2O溶液,调节溶液pH,置于一定温度水浴搅拌反应一定时间[10,19]。反应完毕后,65 ℃浓缩至原体积的1/3,冷却后加入4倍体积的95%乙醇沉淀,4 ℃静止24 h,离心(4000 r/min,10 min)所得沉淀用少量去离子水溶解后用蒸馏水透析24 h,透析产物用95%乙醇醇析得沉淀物,50 ℃真空干燥得锌多糖。

1.2.4.1 单因素实验 硫酸锌添加量对锌多糖制备的影响:设定pH为6,反应温度为70 ℃,反应时间为2 h,以多糖与硫酸锌质量比分别为1.000∶0.200、1.000∶0.400、1.000∶0.600、1.000∶0.800、1.000∶1.000制备锌多糖,考察硫酸锌添加量对锌含量的影响。

pH对锌多糖制备的影响:设定多糖与硫酸锌质量比为1.000∶0.800,反应温度为70 ℃,反应时间为2 h,反应pH分别为4、5、6、7、8制备锌多糖,考察pH对锌含量的影响。

反应温度对锌多糖制备的影响:设定多糖与硫酸锌质量比为1.000∶0.800,反应pH为6,反应时间为2 h,反应温度分别为55、60、65、70、75 ℃制备锌多糖,考察反应温度对锌含量的影响。

反应时间对锌多糖制备的影响:设定多糖与硫酸锌质量比为1.000∶0.800,反应pH为6,反应温度为65 ℃,反应时间分别为1、2、3、4、5 h制备锌多糖,考察反应时间对锌含量的影响。

1.2.4.2 正交实验 根据单因素实验,选取硫酸锌添加量、溶液pH、反应时间、反应温度4个因素进行正交优化实验,以期得到大米胚芽锌多糖制备的最优工艺,以锌含量为指标,正交实验因素水平见表1。

表1 大米胚芽锌多糖正交实验设计因素水平Table 1 Design and factors of orthogonal experiment for zinc polysaccharide in rice germplasm

1.2.4.3 大米胚芽锌多糖配合物中锌元素的测定 锌标准曲线测定:精密配制浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L的锌标准溶液,利用原子吸收分光光度计测定,检测波长213.9 nm,通带1.0 nm,灯电流75%。测得的标准曲线方程为:Y=0.16841X+0.0109,R2=0.9966。式中:Y为吸光度;X为锌离子浓度(mg/L)。

样品的处理及锌离子含量的测定:称取0.100 g左右的大米胚芽锌多糖于消解罐中,加入6 mL优级纯硝酸,2 mL H2O2溶液,使用微波消解仪进行消解样品,最后用超纯水定容至50 mL比色管,摇匀,利用原子吸收分光光度计分别测定其吸光度,其测定条件与标准溶液测定相同,根据锌离子标准曲线计算锌含量,进而利用下列公式计算配合物中锌元素含量。

式中:X-样品中锌元素的含量(mg/g);A-样品中锌的质量浓度(mg/L);F-溶液稀释倍数;V-溶剂体积(mL);M-样品质量(g)。

1.2.5 大米胚芽多糖和大米胚芽锌多糖的结构表征 对产物在190～800 nm波长下进行紫外分析,确定其为目标产物。

1.2.6 抗氧化性测定

1.2.6.1 DPPH·清除实验 将多糖与锌多糖的样品溶液(1 mg/mL)用蒸馏水稀释至0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL,分别取稀释后样品溶液3 mL加入0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液3 mL于试管中,混匀后避光静置30 min,以蒸馏水代替样品做空白组,在517 nm处测定吸光值,做三组平行样[20]。按照下式计算清除率。

式中:A0:空白组的吸光度;A:样品溶液的吸光度。

式中:A0:空白组的吸光度;A:样品溶液的吸光度。

1.2.6.3 ·OH清除实验 将1 mg/mL的样品溶液用蒸馏水分别稀释为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL的待测物溶液,分别取2 mL上述待测物溶液于试管中,依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L水杨酸乙醇溶液2 mL,最后加入8 mmol/L的H2O2溶液2 mL以启动反应,37 ℃水浴加热30 min后终止反应,蒸馏水做空白对照,于510 nm测定吸光度,做三组平行样[22]。按照下式计算清除率。

式中:A0:空白组的吸光度;A:样品溶液的吸光度。

1.2.6.4 总还原力测定 参照文献[23]的方法,略作修改。将1 mg/mL的样品溶液用蒸馏水稀释成质量浓度为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL的溶液。分别取1 mL上述溶液于试管中,依次加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)和2.5 mL体积分数1%的铁氰化钾溶液,混匀,在50 ℃保温20 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸终止反应,混合后以3000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL,加蒸馏水2.5 mL和0.5 mL 0.1%的FeCl3,静置10 min,在700 nm 波长处测定吸光度,做三组平行样。

1.3 数据处理

采用Excel软件进行数据统计分析并作图,且所有实验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 大米胚芽多糖提取率和多糖含量

采用超声法辅助提取大米胚芽多糖,其多糖提取率为16.24%;根据葡萄糖标准曲线测得去除阳离子的大米胚芽多糖含量为76.42%。

2.2 大米胚芽锌多糖制备实验

2.2.1 多糖与硫酸锌质量比对锌多糖制备的影响 由图1可知,多糖与硫酸锌质量比增加时,锌含量随之增加,当质量比(1.000∶0.800)进一步增加时,锌含量却随之下降,是因为锌离子浓度越大,会增加米胚多糖与金属离子之间的静电作用,从而降低锌含量[10]。故选择多糖与硫酸锌质量比为(1.000∶0.800)时,锌多糖中锌含量最高。

图1 多糖与硫酸锌质量比对配合物反应的影响Fig.1 The effect of the ratio of polysaccharide and zinc sulfate on the reaction of complexes

2.2.2 pH对锌多糖制备的影响 由图2可知,随着pH增大锌含量也随着增大,当pH增加到6之后锌含量随之减少,主要是因为锌离子与OH-优先结合生成沉淀,从而影响锌多糖中锌含量。这与陈平[13]研究的食用菌中多糖与锌离子配合工艺优化中不同pH对锌含量有不同的影响结论相似。故选择pH为6时,锌多糖中锌含量最高。

图2 pH对配合物反应的影响Fig.2 Effect of pH on the reaction of complexes

2.2.3 反应温度对锌多糖制备的影响 由图3可知,反应温度会影响分子之间的运动,随着温度的升高,锌含量先增大后减少,当温度大于65 ℃时，锌含量急剧下降，不适合体系的反应。故选择反应温度为65 ℃,锌多糖中锌含量最高。

图3 温度对配合物反应的影响Fig.3 Effect of temperature on the reaction of complexes

2.2.4 反应时间对锌多糖制备的影响 由图4可知,反应时间对锌含量影响较小,当反应时间为3 h时,锌含量达到最大,之后逐渐减小,是因为配合物逐渐开始解离,使锌多糖中锌含量减少。

图4 反应时间对配合物反应的影响Fig.4 Effect of reaction time on the reaction of complexes

2.3 大米胚芽锌多糖制备的正交实验优化结果

通过表3可以直观的看出,以锌含量为指标,各因素对大米胚芽锌多糖制备的影响顺序为:A>B>D>C,即:硫酸锌添加量>溶液pH>反应时间>反应温度。最佳合成工艺为:A2B2C3D1,即多糖与硫酸锌质量比(1.000∶0.800)、溶液pH为6、反应温度65 ℃、反应时间2.5 h,所得锌含量为5.594 mg/g。

表3 大米胚芽锌多糖正交实验优化结果Table 3 Orthogonal test optimization of zinc polysaccharide in rice germ

2.4 验证性实验

称取3份多糖各1.000 g置于烧杯中,使用正交实验所得最适宜的条件进行锌多糖的制备,按照1.2.4.3的实验方法对锌多糖中锌的含量进行测定,3次重复取平均值后测得锌多糖配合物中含有(5.617±0.279) mg/g的锌元素,接近于正交实验所得的值5.594 mg/g。

2.5 大米胚芽多糖和大米胚芽锌多糖紫外图谱

从图5和图6可知,大米胚芽多糖和大米胚芽锌多糖的紫外光谱在260 nm和280 nm附近均无明显特征吸收峰,可能是核酸和蛋白质含量很低的缘故。而大米胚芽锌多糖在200 nm处出现明显的特征吸收峰,存在明显的差异,峰值的变化说明大米胚芽多糖结构发生了变化,由此推测大米胚芽多糖中成功的引入锌离子。

图5 大米胚芽多糖紫外吸收光谱图Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of rice germ polysaccharides

图6 大米胚芽锌多糖紫外吸收光谱图Fig.6 Ultraviolet absorption spectra of rice germ zinc polysaccharide

2.6 抗氧化性测定结果

2.6.1 DPPH·清除实验结果 在实验设置的浓度范围内,随着多糖和锌多糖浓度的增加,对DPPH自由基的清除率也逐渐增加,均表现出量效关系,但清除作用均小于VC。当浓度为1.8 mg/mL时,大米胚芽锌多糖、大米胚芽多糖对DPPH自由基的清除率分别为62.15%、57.76%,其IC50值分别为0.94、1.14 mg/mL,而VC在浓度1 mg/mL时清除率达到94%以上,如图7所示。

图7 大米胚芽多糖和锌多糖对DPPH·清除效果Fig.7 Effects of rice germ polysaccharide and zinc polysaccharide on DPPH· removal

图8 大米胚芽多糖和锌多糖对清除效果Fig.8 Effect of rice germ polysaccharide and zinc polysaccharide on ·scavenging

2.6.3 ·OH清除实验结果 大米胚芽多糖和大米胚芽锌多糖随浓度的增加,对·OH自由基的清除率也在逐渐增加,均表现出量效关系。当浓度为1.8 mg/mL时,大米胚芽锌多糖、大米胚芽多糖对·OH自由基的清除率分别为61.89%、56.94%,均低于VC,其IC50值分别为0.71、0.91 mg/mL,当浓度为1.0 mg/mL时,两者对羟自由基的清除能力趋于平缓,VC的清除率达到96%以上,可见大米胚芽锌多糖和大米胚芽多糖的清除率与VC的羟自由基清除能力差异较大,见图9。

图9 大米胚芽多糖和锌多糖对·OH清除效果Fig.9 Effect of rice germ polysaccharide and zinc polysaccharide on · OH removal

2.6.4 总还原力测定结果 大米胚芽多糖、大米胚芽锌多糖均具有一定的还原力,在实验设置的浓度范围内,随着质量浓度的增加,其还原力也增加,见图10所示。

图10 大米胚芽多糖和锌多糖的总还原力Fig.10 The total reducing power of rice germ polysaccharide and zinc polysaccharide

3 结论

以锌含量为指标,采用L9(34)正交设计优化大米胚芽锌多糖的制备工艺,确定适宜合成工艺为:多糖与硫酸锌质量比(1.000∶0.800)、溶液pH为6、反应温度65 ℃、反应时间2.5 h。在此条件下重复3次实验,测得大米胚芽锌多糖中含有(5.617±0.279) mg/g的锌元素。

大米胚芽多糖和大米胚芽锌多糖的抗氧化实验表明,在实验设置的浓度范围内,随着浓度的增加,大米胚芽锌多糖对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除能力也逐渐增强且均强于大米胚芽多糖,其还原力也强于大米胚芽多糖。实验可为大米胚芽多糖、大米胚芽锌多糖开发功能性保健食品或药品提供理论基础。

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Preparation and antioxidant activity of rice germ Zn2+-polysaccharide

LUO Min1,CHEN De-jing2,*,SU Wen1

(1.School of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China; 2.Provincial Bio-resource Key Laboratory,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China)

The polysaccharide was extracted from rice germ The polysaccharide complex of rice germ zinc was prepared with polysaccharide and zinc sulfate as raw materials and its activity was studied. The results showed that the optimum preparation conditions were as follows:the mass ratio of polysaccharide to zinc sulfate(1.000∶0.800),the pH value of the solution was 6.0,the reaction temperature was 65 ℃,and the reaction time was 2.5 h. Under these conditions,the content of zinc in the zinc polysaccharide complex was(5.617±0.279) mg/g. In addition,the scavenging rate of DPPH free radicals was 57.76% and 62.15% respectively. The scavenging rate of superoxide anion radical was 60.11% and 67.44% respectively. The scavenging rate of hydroxyl radical was 56.94% and 61.89%. The reduction force increases with increasing concentration. It could be seen that the polysaccharide of rice germ had more antioxidant activity than rice germ polysaccharide.

rice germ poly-saccharide;polysaccharide;Zn polysaccharides;antioxidant activity

2016-12-20

罗敏(1990-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品生物化学，E-mail:1053378593@qq.com。

*通讯作者:陈德经(1961-)，男，硕士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail:cdjslg@126.com。

陕西省农业攻关项目(2015NY012)；汉中市汉台区科学技术计划项目(2014JX1-22)。

TS210.1

B

1002-0306(2017)14-0238-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.046