叶 青,许云贺,张莉力,*(.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州000; .锦州医科大学畜牧兽医学院,辽宁锦州000)



利用干酪乳杆菌YQ336制备酸浆豆腐凝固剂的发酵条件优化

叶 青1,许云贺2,张莉力1,*
(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州121000; 2.锦州医科大学畜牧兽医学院,辽宁锦州121000)

以产酸量和菌体密度为指标,利用单因素实验和响应面实验,从发酵时间、发酵温度、初始pH、接种量、碳源及碳源添加量几个方面,对从自然发酵酸浆中分离出的一株干酪乳杆菌YQ336进行发酵条件的优化。最优发酵条件为:发酵时间48 h、发酵温度37 ℃、初始pH6.0,接种量3%,碳源为葡萄糖,添加量5%,此时乳酸产量为28.81 g/L,总酸产量为34.245 g/L。实验结果表明干酪乳杆菌YQ336可以在此条件下发酵为纯种酸浆豆腐凝固剂,并用于工业生产点制酸浆豆腐。

干酪乳杆菌,酸浆豆腐,豆腐凝固剂,高效液相色谱

酸浆豆腐在我国有上千年的加工历史。酸浆是豆腐制作过程中产生的废水——黄浆水经自然发酵变酸即为酸浆,酸浆是利用其所含的乳酸来制作豆腐,制成的豆腐更为醇香[1-3]。与石膏、盐卤以及内酯等外来物种相比,源自豆腐本身的酸浆更为天然、绿色和安全;同时,减少了豆腐废水排放造成的环境污染[4]。但是,传统的酸浆是自然发酵的产物,受环境因素的影响较大,很难控制酸浆的酸度,导致了生产的酸浆豆腐品质很不稳定。另一方面,自然发酵过程中,除有益菌外,还有许多腐败杂菌的存在,从而会导致所生产的酸浆豆腐保质期短[5]。如果将酸浆改为严格的纯种发酵,将解决以上两个问题。

黄浆水营养成分丰富,只需补充适量碳源即可满足微生物生长需要[6]。吕博[7]在研究发酵黄浆水有机酸凝固剂制备时发现,酸浆中乳酸含量越多,豆腐的乳香味越浓,本文经过大量实验后,决定以豆腐黄浆水添加适量碳源为培养基,通过单因素实验和响应面法对从自然发酵酸浆中分离出的一株产酸能力强的乳酸菌[8],即干酪乳杆菌YQ336进行发酵条件的优化,并利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定其产乳酸量[9]。该干酪乳杆菌YQ336可接种于豆腐黄浆水中发酵成为豆腐凝固剂,本研究使用的黄浆水均是由该乳酸菌的发酵液作为豆腐凝固剂点制酸浆豆腐后过滤而来,黄浆水既可用做培养基,其发酵液又可作为豆腐凝固剂,如此重复利用,充分利用资源且保护环境。本研究采用食品级大豆,以天然的豆腐黄浆水为基础,不引入化学试剂,只添加少量无害的碳源,优化纯种酸浆的发酵条件,使干酪乳杆菌YQ336的产酸能力达到最优,为酸浆豆腐的工业化生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食品级大豆 购于锦州新玛特超市;黄浆水 酸浆豆腐制作过程中的副产物,实验室自制;干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)YQ336 本实验室分离且已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 12796;黄浆水培养基 新鲜黄浆水加入2%葡萄糖;葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、氢氧化钠、乙腈、磷酸、琼脂 分析纯,天津市科密欧化学试剂。

SW-CJ-1C型超净工作台 苏州净化设备有限公司;YXQ-LS型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司;M4-AL204型电子分析天平 兰州中西仪器;DHP-9082型恒温培养箱 金坛市鑫鑫实验仪器厂;DHP-9052型 pH计 上海一恒科技有限公司;UV-1600型紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;LC-15C型高效液相色谱仪 岛津企业管理(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 干酪乳杆菌YQ336的活化 黄浆水培养基接种干酪乳杆菌YQ336培养进行活化,37 ℃恒温培养,测定其活菌数,以24 h内达到活菌数>106CFU/mL止[10-11]。

1.2.2 实验室自制黄浆水及豆腐凝固剂的制作 首先在实验室以醋酸为凝固剂点制豆腐,留压制豆腐后剩余的黄浆水加2%葡萄糖,调pH6.0,于115 ℃灭菌30 min后接种活化好的干酪乳杆菌YQ336,37 ℃恒温发酵24 h,即为一代豆腐凝固剂。用一代豆腐凝固剂点制豆腐,剩余的黄浆水加2%葡萄糖,调pH6.0,于115 ℃灭菌30 min后接种3%一代豆腐凝固剂,37 ℃恒温发酵24 h,即为二代豆腐凝固剂。用二代豆腐凝固剂点制豆腐,剩余的黄浆水加2%葡萄糖,调pH6.0,于115 ℃灭菌30 min后接种3%二代豆腐凝固剂,37 ℃恒温发酵24 h,即为三代豆腐凝固剂(如此可以消除醋酸对后续实验的影响)[1]。三代后的凝固剂即为本实验所用的豆腐凝固剂,用三代后豆腐凝固剂点制豆腐剩余的黄浆水即为本实验所用的黄浆水。

1.2.3 接种液的制备 在黄浆水中添加2%的葡萄糖,调整初始pH为6.0,115 ℃灭菌30 min,接种3%活化好的干酪乳杆菌YQ336,37 ℃培养24 h,即为接种液,备用。

1.2.4 单因素实验 以产酸量、OD值为指标,主要考察碳源、发酵时间、发酵温度、初始pH、种子液接种量、碳源添加量六个因素对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响。碳源:固定种子液接种量3%、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h、初始pH6.0,固定添加量为2%,改变碳源分别为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖;发酵时间:固定种子液接种量3%、葡萄糖添加量2%、发酵温度37 ℃、初始pH6.0,改变发酵时间为12、24、48、72、96、120、144 h;发酵温度:固定种子液接种量3%、葡萄糖添加量2%、发酵时间24 h、初始pH6.0,改变发酵温度为15、20、25、30、35、40、45 ℃;初始pH:固定种子液接种量3%、葡萄糖添加量2%、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h,初始pH分别设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0;种子液接种量:固定葡萄糖添加量2%、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h、初始pH6.0,改变种子液接种量为1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%;碳源添加量:固定种子液接种量3%、发酵温度37 ℃、发酵时间24 h、初始pH6.0,改变碳源添加量为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%。

1.2.5 响应面法优化发酵条件 在单因素实验的基础上,以发酵温度、初始pH、种子液接种量3个因素为自变量,以产酸量为响应值,利用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken设计法设计3因素3水平响应面实验,对干酪乳杆菌YQ336发酵条件进行优化[12-14]。实验因素和水平见表1。

表1 响应面实验因素与水平Table 1 Factors and levels ofresponse surface methodology

1.2.6 指标测定

1.2.6.1 产酸量的测定 按照国标GB/T 12456-2008。

1.2.6.2 pH 采用DHP-9052型酸度计测定。

1.2.6.3 OD值 采用紫外分光光度法,波长600 nm,将发酵液稀释20倍后,以未接菌的培养基为空白,测菌体密度。

1.2.6.4 产乳酸量的测定 高效液相色谱法,色谱柱为WondaSil C18-WR(250 mm×4.6 mm,5 μL),色谱条件为:检测波长210 nm,流动相(乙腈∶pH2.0磷酸=10∶90),柱温为35 ℃,进样量10 μL,流速0.8 mL/min。流动相配制好后分别过0.45 μm滤膜待用。乳酸标准品制备:经过预实验后,将标准品稀释到0.5、1、2、3、4 mg/mL五个梯度,4 ℃保存。样品处理:将样品于50 ℃超声提取20 min,稀释十倍后过0.22 μm滤膜待用[15]。

1.3 数据处理

数据折线图和标准曲线采用 Excel 2007制作,数据统计采用SPSS 19.0进行ANOVA单因素方差分析及S-N-K多重检验(p<0.05),数值以均值±标准差表示。响应面实验采用采用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken设计法分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同碳源对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响 由图1可知,综合五种碳源下干酪乳杆菌YQ336的产酸量和OD值,葡萄糖的产酸量和菌体密度最优,分别为(24.41±0.11)g/L和0.534±0.006,与其他碳源结果差异显著(p<0. 05)。因此葡萄糖为最优碳源,更适合提供黄浆水中缺乏的营养素。

图1 不同碳源对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336注:同一测定指标,字母不同表示差异显著 (p<0.05);图1～图6同。

2.1.2 发酵时间对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响 由图2可以看出,随发酵时间的延长,产酸量和菌体密度先升高后稳定基本不变,48 h时最大产酸量为(23.24±0.14) g/L。菌体密度随时间延长先升高后略有降低,可能是48 h前为菌体生长对数期菌体密度达到最高,48～72 h为稳定期变化不显著(p>0.05),96 h后进入衰亡期,细菌死亡解体,OD值与72 h，前呈差异显著(p<0.05)。因此,出于节约时间考虑，发酵时间以48 h为宜。

图2 发酵时间对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响Fig.2 Effect of fermentation time on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.1.3 发酵温度对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响 由图3可以看出,随发酵温度的升高,产酸量和菌体密度均先升高后降低,35 ℃与40 ℃的菌体密度无显著差异(p>0.05),产酸量与其他各组相比呈显著差异(p<0.05),40 ℃时产酸量最高为(21.72±0.12) g/L,稀释20倍后测得的菌体密度最高为0.558±0.004。说明温度过高抑制干酪乳杆菌的生长,因此发酵温度以40 ℃为宜。

图3 发酵温度对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.1.4 初始pH对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响 由图4可知,pH由5～7时,产酸量和菌体密度先上升后下降,可能偏酸性环境适宜该乳酸菌生长,综合考虑pH为5.5时两个指标的平均值最优,产酸量为(24.4±0.11)g/L,菌体密度为0.647±0.007。

图4 初始pH对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响Fig.4 Effect of initial pH on fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.1.5 种子液接种量对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响 由图5可以看出,3%接种量时,产酸量与OD值最优,且均与其他水平呈显著差异(p<0.05),此时产酸量为(24.87±0.11) g/L,OD值为0.664±0.005。因此3%接种量更适合该菌种的发酵。

图5 种子液接种量对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响Fig.5 Effect of inoculation amount of seed liquid on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.1.6 葡萄糖添加量对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响 根据图6可知,随着葡萄糖添加量的增多,产酸量和OD值均升高,最高时为产酸量(24.21±0.12) g/L,OD值0.557±0.006,此时葡萄糖的添加量为5%,产酸量与其余各组间呈显著差异(p<0.05),因此选择5%的添加量为宜。

图6 葡萄糖添加量对干酪乳杆菌YQ336发酵的影响Fig.6 Effect of glucose addition on the fermentation of Lactobacillus casei YQ336

2.2 响应面优化发酵条件

2.2.1 响应面实验结果 采用SPSS 19.0进行ANOVA单因素方差分析及S-N-K多重检验(p<0.05)对六组单因素水平进行筛选,最终确定以初始pH、发酵温度、种子液接种量3个因素为主要考察因素,以产酸量为考察指标对干酪乳杆菌YQ336的发酵条件进行响应面实验,实验设计与结果见表2,方差分析见表3。

表3 响应面实验方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology

注:**:差异极显著,p<0.01;*:差异显著,p<0.05。

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Design and results of response surface methodology

利用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken设计法对表2数据进行多远二次回归拟合,得到回归模型方程为:Y=31.98+3.83A+0.67B+3.98C-0.073AB+1.27AC+0.14BC-1.48A2-0.058B2-4.36C2。

2.2.2 响应面分析 保持三个因素中的一个为最优,其他两个因素与响应值关系用三维坐标图表示,可直观反映各因素对响应值的影响关系。等高线的形状可以反映出因素之间交互效应的强弱,圆形表示不显著,而椭圆则表示显著[16-17]。结果见图7。

图7 初始pH、接种量、发酵温度的交互作用对干酪乳杆菌YQ336发酵条件影响的等高线和响应面图Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction among initial pH,inoculum size and fermentation temperature on the fermentation conditions of Lactobacillus casei YQ336

比较各因素间两两相互作用的响应面曲线图和等高线图,可以看出AB、BC的等高线图形均为扁圆形近似圆形且响应面图形曲线趋势均较平缓,而AC的等高线图形为椭圆形且响应面图形曲线趋势陡峭,表明初始pH和接种量两个自变量之间以及接种量和发酵温度两个自变量之间的交互效应较弱,初始pH和发酵温度两个自变量之间的交互效应较强。

2.2.3 最佳发酵条件 根据Design-Expert 8.0.6软件求出的回归模型极值点,结果表明得出最高指标时各个因素组合为:A=6.21,B=3.16,C=36.63,即初始pH为6.21,接种量为3.16%,发酵温度为36.63 ℃,此时产酸量最高为35.1472 g/L。为方便生产应用调整初始pH为6,接种量为3%,发酵温度为37 ℃。以调整后的发酵条件进行三次认证实验,得到pH为3.37,产总酸量为34.245 g/L,是回归预测理论值35.1472 g/L的97.43%,说明该方程与实际情况拟合良好,适用于对干酪乳杆菌YQ336发酵条件进行回归分析和参数优化。

2.2.4 产乳酸量的测定结果 响应面优化后,利用HPLC法测最优发酵条件下干酪乳杆菌YQ336的产乳酸量,乳酸标样的标准曲线见图8。

图8 乳酸标准样品的标准曲线Fig.8 Standard curve of lactic acid standard sample

乳酸标样出峰时间为2.769 min,根据乳酸标样不同浓度的峰面积做出如图8所示的标准曲线Y=2779X-82.596,R2=0.9996。表明这种色谱条件下测出的乳酸线性关系很好。根据样品峰面积计算出干酪乳杆菌YQ336在响应面最优条件下产乳酸量为28.81 g/L,是刘冬梅[18]等人测定干酪乳杆菌在泡菜液中发酵48 h后产乳酸量13.696 g/L的2.1倍。

3 结论

本研究综合单因素实验和响应面实验产乳酸量的结果,得出最适干酪乳杆菌YQ336发酵的条件为:发酵温度为37 ℃,初始pH为6,发酵时间为48 h,接种量为3%,葡萄糖添加量为5%,在此条件下发酵,可得到pH为3.37,产酸量为34.245 g/L,产乳酸量为28.81 g/L的酸浆。该乳酸菌分离筛选自自然发酵的酸浆中,产乳酸量能力强,纯种发酵无有害菌掺入,作为豆腐凝固剂使用,延长了酸浆豆腐的保质期,可以代替自然发酵酸浆,作为一种新型的酸浆豆腐凝固剂进行工业生产和走入家庭。

[1]张影,刘志明,刘卫,等. 酸浆豆腐的工艺研究[J]. 农产品加工,2014,344(2):21-26.

[2]C G Viderola,P Mocchiutti,J A Reinheimer. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products[J]. J Dairy Sci,2002,85(3):721-729.

[3]王爱伟,孙冰洁.酸浆豆腐废水中发酵假丝酵母的研究[J].中国酿造,2009(10):44-46.

[4]李燕. 酸浆中微生物的应用研究[D]. 济南:山东轻工业学院,2003.

[5]乔支红,闫佳,陈虹,等. 酸浆标准化生产工艺的研究[J]. 食品工业科技,2015,36(12):162-164.

[6]赵贵丽,罗爱平,廖娅凡,等.酸浆最适自然发酵条件优化[J].食品科学,2013,34(17):201-204.

[7]吕博. 发酵黄浆水有机酸凝固剂的制备及应用研究[D]. 哈尔滨:哈尔滨商业大学,2014.

[8]Wright B E,Longacre A,Reimers J. Models of metabolism in Rhizopus oryzae[J]. J Theor Biol,1996,182:453-457.

[9]Giusti F,Caprioli G,Ricciutelli M,et al. Determination of fourteen polyphenols in pulses by high performance liquid chromatography-diode array detection(HPLC-DAD)and correlation study with antioxidant activity and colour[J]. Food Chemistry,2017,221(4):689-697.

[10]中华人民共和国卫生部.GB 4789.2-2010食品微生物学检验 菌落总数测定[S].北京:中国标准出版社,2010.

[11]尹彦洋,罗爱平,李施,等.两种乳杆菌协同发酵牛骨粉促钙转化的工艺研究[J].食品科学,2009(21):178-183.

[12]刘松,李祝,周礼红,等. 响应面法优化黑曲霉产纤维素酶的发酵条件[J]. 食品科学,2013(17):225-229.

[13]Chmiel T,Kupska M,Wardencki W. Application of response surface methodology to optimize solid-phase microextraction procedure for chromatographic determination of aroma-activemonoterpenes in berries[J]. Food Chemistry,2017,221(4):1041-1056.

[14]Raza A,Feng Li,Xiuquan Xu. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of antioxidant polysaccharides from the stem of Trapa quadrispinosa using response surface methodology[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2017,94(1):335-344.

[15]郭子好,方华,夏志生,等. 反相高效液相色谱法测定发酵豆粕中的乳酸含量[J]. 饲料工业,2014,S1:121-123.

[16]张安宁,刘连成. 响应面法优化香菇液体发酵条件[J]. 江苏农业科学,2014(3):200-203.

[17]Torchio F,Giacosa S,Vilanova M,et al. Use of response surface methodology for the assessment of changes in the volatile composition of Moscato bianco(Vitis vinifera L.)grape berries during ripening[J]. Food Chemistry,2016,212(10):576-584.

[18]刘冬梅,吴晖,余以刚,等. 高效液相色谱法对泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定[J]. 现代食品科技,2007(8):74-76.

Optimization of fermentation conditions for preparation of
acid slurry bean curd coagulants byLactobacilluscaseiYQ336

YE Qing1,XU Yun-he2,ZHANG Li-li1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China; 2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

Using single factor experiments and response surface experiments,with the acid yield and cell density as indicators,the optimization of fermentation condition ofLactobacilluscaseiYQ336 isolated from natural fermentative acid juice was carried out from the aspects of fermentation time,fermentation temperature,initial pH,inoculation amount,carbon source and carbon source addition.The optimum fermentation conditions were as follows:fermentation time 48 h,fermentation temperature 37 ℃,initial pH6.0,inoculation amount 3%,carbon source was glucose,adding 5%,under this condition,lactic acid production was 28.81 g/L,total acid yield was 34.245 g/L.The results showed thatLactobacilluscaseiYQ336 could be fermented into acid slurry bean curd coagulant under this condition and used in industrial production point to make acid slurry bean curd.

Lactobacilluscasei;acid slurry bean curd;tofu coagulant;high performance liquid chromatography(HPLC)

2017-02-07

叶青(1993-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：18741650927@163.com。

*通讯作者:张莉力(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail：lilyzhang1977@163.com。

国家自然科学基金项目(31301499)；辽宁省自然科学基金项目(2014022052)；辽宁省自然科学基金项目(2014022046)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0106-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.021