胡园园,易若琨,王仲明,聂旭元,骞 宇,赵 欣(重庆第二师范学院,功能性食品协同创新中心,重庆 400067)



苦荞中D-手性肌醇的纯化及其抗氧化活性研究

胡园园,易若琨,王仲明,聂旭元,骞 宇,赵 欣*
(重庆第二师范学院,功能性食品协同创新中心,重庆 400067)

采用超声浸提法提取苦荞D-手性肌醇(DCI),通过高碘酸钠氧化法测定DCI含量,利用活性炭柱分离纯化苦荞粗提物,高效液相色谱法(HPLC)分析粗提物和纯化产物的组成及含量。以VC、BHT为对照,通过对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子的体外抗氧化评价体系和总还原力的测定,评价对比苦荞DCI粗提物和纯化产物的抗氧化活性。结果表明,苦荞粗提物中D-手性肌醇的含量仅为0.129%,经活性炭柱纯化后,苦荞中D-手性肌醇的含量可以达到27.26%;苦荞DCI提取物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基均具有不同程度的清除作用,同时具有较好的还原性，且DCI纯化产物的抗氧化活性要明显强于DCI粗提物。

苦荞,D-手性肌醇,活性炭,高效液相色谱法,抗氧化

研究表明自由基(free radical)是引起癌症、衰老、心脑血管退变性等疾病的重要原因之一[1]。当机体处于衰老状态时,体内会产生大量的自由基,而抗氧化剂可以有效地消除自由基,使机体达到氧化还原平衡[2]。D-手性肌醇(DCI)为肌醇的一种,具有光学活性体,属于B族维生素中水溶性维生素[3],研究表明D-手性肌醇除了具有肌醇促进肝脏脂代谢的功能外,还具有胰岛素增敏、保护肝损伤、降血脂和降血糖等多种生理功能[4]。此外,张泽生[5]发现D-手性肌醇和肌醇均能显著或极显著提高小鼠不同组织中超氧化物歧化酶、总超氧化能力和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,同时降低丙二醛的含量,对衰老的小鼠表现出有效的抗氧化效果,但是目前对于D-手性肌醇体外抗氧化活性的研究未见报道。苦荞作为中国一种传统的药食两用植物资源,不仅含有丰富的生物类黄酮,也含有少量的D-手性肌醇单体[6]。目前关于苦荞的研究,多数集中在对苦荞黄酮类化合物的功能活性研究,而苦荞中DCI的抗氧化活性鲜有报道。本研究从苦荞籽粒中提取D-手性肌醇并进行纯化,然后对其纯化前后的体外抗氧化活性进行测定,以期为苦荞D-手性肌醇的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦荞籽粒 宁强县羌州粮食有限公司提供;铁氰化钾、FeSO4、三氯乙酸(TCA)、高碘酸钠、醋酸钠、氯化铁 均为分析纯;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS) 均购自天津市富晨化学试剂厂;色谱级乙腈 购自美国Honeywell公司;无水乙醇、水杨酸、抗坏血酸、丁化羟基甲苯(BHT)、H2O2、D-手性肌醇(纯度为99%)、粒状活性炭 均为分析纯,购自天津市天天化学试剂厂;蒸馏水和超纯水 为实验室自制。

RE-52AA旋转蒸发仪 上海科恒实验发展有限公司;YXJ-2高速台式离心机 常州恒隆仪器有限公司;752N-紫外可见分光光度计 上海精科;KQ-300DE超声波清洗器 上海五相仪器仪表有限公司;BPG-9030AH高温烘箱 上海和呈仪器制造有限公司;EZ-DRY真空冷冻干燥仪 杭州丰漠冷冻设备制造有限公司;大孔吸附树脂柱(Φ 30 mm×310 mm) 天津市东丽区天天化学试剂厂;MILLI-Q超纯水仪 MILLIPORE公司;HH-6B数显恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司;AL104分析电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;FZ102微型植物粉碎机 黄骅市中兴有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苦荞中DCI的提取 参照卢丞文[7]的研究,选取超声波浸提法提取苦荞中DCI。先取适量的苦荞籽粒,用粉碎机粉碎后,粉末过60目筛,称取50 g,与体积分数为50%的乙醇溶液按1∶1 (g/mL)的比例混合均匀,并于50 ℃恒温水浴超声(功率为175 W)振荡提取2 h,重复提取三次,合并提取液,3000 r/min离心10 min,取上清液,于65 ℃恒温旋转蒸发得到DCI浓缩液,然后置于真空冷冻干燥仪中冷冻干燥(加热温度为50 ℃,干燥室压力为80 Pa),得到苦荞DCI粗提物粉末,备用。

1.2.2 高碘酸钠氧化法测定DCI含量

1.2.2.1 D-手性肌醇的标准曲线制作 参照文献[8],称取适量的D-手性肌醇标品,配制成一系列不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L)的DCI标准水溶液,各取2.0 mL分别加入4.0 mL的醋酸钠缓冲液(pH4.5)和1.2 mL的高碘酸钠溶液(0.01 mmol/L)后,于260 nm处测其吸光度(a),避光,于65 ℃水浴保存2 h,冷却后,再测定260 nm吸光度(b),计算吸光值的变化情况(a-b),并以吸光值变化为纵坐标,以标准液浓度为横坐标制作标准曲线。

1.2.2.2 D-手性肌醇含量的测定 称取适量的苦荞DCI粗提物,用蒸馏水溶解并于50 mL容量瓶中定容。使用1.2.2.1中的方法测定吸光值的变化,根据标准曲线计算DCI含量。

1.2.3 活性炭柱层析法分离纯化D-手性肌醇 参照胡俊君的研究[9],采用30 mm×310 mm的色谱柱,称取一定量的活性炭颗粒,采用湿法装柱,将活性炭颗粒浸入过量的洗脱液中,搅拌均匀后,倾入色谱柱中。活性炭颗粒沉淀稳定后,称取1 g DCI粗提物,加入60 mL体积分数50%的乙醇溶液溶解,并将上样液的pH调至6～8,用体积分数为4%的乙醇溶液(pH3～4)进行洗脱,流速为0.2 mL/min,用带刻度的试管收集洗脱液,每管收集6 mL,收集液隔管用高碘酸钠氧化法跟踪检测,并于260 nm下测定吸光度,直至洗脱完全,然后合并洗脱液,减压蒸馏,真空冷冻干燥(温度50 ℃,压力80 Pa)后得到纯化后的苦荞DCI提取物粉末,即DCI纯化产物。

1.2.4 HPLC分析苦荞DCI提取物的组成 参照本课题组已经建立的高效液相色谱分析方法[4]。用70%的乙腈水溶液溶解DCI标准品和样品,使其浓度分别为0.18 mg/mL和1.8 mg/mL,然后用0.45 μm微孔滤膜过滤,取滤液备用。采用岛津公司HPLC仪,示差折光检测器,酰胺柱(4.6 mm i.d.×150 mm,5 μm)测定,洗脱液为体积分数为81%的乙腈溶液,流速为1.0 mL/min,柱温为30 ℃,检测波长为512 nm,进样量为20 μL。

1.2.5 D-手性肌醇体外抗氧化活性研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力测定 参照文献[10]并稍作修改,评价对比纯化前后的苦荞DCI提取物对DPPH自由基的清除能力。将3.0 mL DPPH(1 mmol)溶液与1.0 mL不同浓度的样品溶液分别加入试管中,充分混合,黑暗处理30 min,517 nm处测定吸光值。抗坏血酸作阳性对照,用蒸馏水做阴性对照,用甲醇代替DPPH做本底组对照。清除率按以下方法计算:

清除率(%)=[1-(Aa-Ab)/A0]×100

式中,Aa为样品吸光值,Ab为样品本底吸光值,A0为阴性对照值。

1.2.5.2 羟基自由基的清除能力测定 采用Fenton体系法[11]评价对比纯化前后的DCI提取物对羟基自由基的清除能力。向10 mL离心管中依次加入1.0 mL样品溶液,1.0 mL FeSO4溶液,1.0 mL水杨酸-乙醇溶液和1.0 mL H2O2溶液,37 ℃条件下水浴1 h,然后于510 nm处测定其吸光值。用蒸馏水做阴性对照和样品本底对照。清除率的计算:

清除率(%)=[1-(Aa-Ab)/A0]×100

式中,Aa为样品吸光值,Ab为样品本底吸光值,A0为空白对照液的吸光度。

清除率(%)=[1-(Aa-Ab)/A0]×100

式中,Aa为样品吸光值,Ab为样品本底吸光值,A0为阴性对照值。

1.2.5.4 总还原能力测定 参考文献[13]并修改,对DCI粗提物及DCI纯化产物的总还原能力做对比和评价。取各浓度的样品溶液1.0 mL,依次加入2.5 mL的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.6)和2.5 mL的1% K3[Fe(CN)6],50 ℃条件下水浴20 min后,再加入10% W/V的TCA(2.5 mL),混匀,并在3000 r/min下离心10 min,取2.0 mL的上清液于试管中,依次加入去离子水(2.0 mL)和0.1%的氯化铁(0.5 mL),混匀,静置10 min后,于700 nm处测定其吸光度值。用蒸馏水代替0.1%氯化铁溶液做本底对照。

1.3 数据分析

所有实验均重复三次,并采用SPSS 13.0软件对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 D-手性肌醇标准曲线的测定

以标准DCI浓度为横坐标,其对应吸光值为纵坐标,绘得DCI标准曲线,建立回归方程。得到其标准曲线如图1 所示。

图1 DCI含量标准曲线图Fig.1 The standard curve of D-chiro-inositol content

2.2 苦荞粗提物的纯化

按照上述1.2.3的方法,采用活性炭柱层析分离苦荞粗提物中DCI。胡俊君已报道用体积分数为4%的乙醇洗脱液对DCI进行洗脱效果最佳[9],因此本研究选用体积分数为4%的乙醇溶液作为洗脱液进行DCI的洗脱。结果如图2所示,活性炭柱层析分离纯化得到了DCI的主要洗脱峰,表明洗脱液的成分较纯,组分相对单一。收集所有洗脱液,真空冷冻干燥后得到纯度较高的苦荞DCI纯化产物粉末。

图2 DCI纯化产物的活性炭柱层析图Fig.2 Eluting curve of DCI on activated carbon column

由图1和表1可知,当苦荞粗提物和纯化产物样品的浓度均为0.05 mg/mL时,其吸光度值分别为0.021和2.75,代入DCI标准曲线中可求得样品中DCI的浓度,经计算得粗提物中DCI的含量为0.129%(w/w);而经过活性炭柱纯化后,纯化产物中DCI的含量可以达到27.26%(w/w),结果表明通过活性炭柱可以较好的纯化苦荞中的DCI。

表1 苦荞DCI的吸光值和纯度Table 1 Absorption values and purity of DCI extract from tartary buckwheat

2.3 HPLC分析苦荞D-手性肌醇提取物的组成

从标准品的高效液相色谱图(图3a)中可以清晰地看出,DCI在此实验条件下可以较好地被分离,色谱峰出峰时间为3.93 min。由标准品(5～25 μL)的5个不同进样量HPLC分析,获得峰面积。以标准品的峰面积(y)为纵坐标,以各DCI物质的量(μmol,x)为横坐标,绘制标准曲线,得到y=1.1×107x+1.9×105(R2=0.998,n=5)。将粗提物和纯化产物分别得到的2个峰面积代入回归曲线中,得出各样品中DCI物质的量,并可计算出各样品中DCI的含量,结果显示与高碘酸钠氧化法测定DCI含量的结果一致。从粗提物样品的高效液相色谱图(图3b)中看出,样品中含有较多的杂质,且检测峰没有完全被分离,而纯化产物的高效液相色谱图(图3c)结果显示杂质相对减少,色谱峰较清晰地被分离,且出峰面积显著增大。结果表明经过活性炭纯化后,部分杂质被去除,DCI的含量显著增加。

图3 标准品(a)、粗提物样品(b)与纯化产物样品(c)高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatography of standards(a)、 crude extracts(b)and purification products(c)

2.4 DCI粗提物与DCI纯化产物的体外抗氧化活性对比

2.4.1 对DPPH自由基的清除功效 DPPH溶液在紫外-可见光区具有较强的吸收光谱,加入抗氧化剂后,自由基被清除,使吸收光谱强度减小,且与加入的抗氧化剂的量呈反比,因此可以通过吸光度的变化计算DPPH自由基清除率[14]。按1.2.5.1方法,以一定浓度的VC、BHT、DCI粗提物和DCI纯化产物为横坐标,以吸光度值计算DPPH·的清除率，为纵坐标,结果见图4。由图4可知,DCI纯化产物对DPPH自由基的清除能力远小于VC,但稍大于DCI粗提物。当浓度为1 mg·mL-1时,VC的清除率可达到98.66%,DCI纯化产物的清除率为58.55%,DCI粗提物的清除率为48.3%,BHT的清除率仅为42.3%,结果表明经活性炭柱纯化后,DCI提取物清除DPPH自由基的能力稍有上升。在0.1～1 mg·mL-1范围内,随着样品浓度的上升,样品对DPPH自由基的清除能力均逐渐增强,表明苦荞DCI提取物具有一定的抗氧化活性。

图4 DCI粗提物与纯化产物对DPPH·的清除能力的比较Fig.4 Comparison between D-chiro-inositol and purified product to the scavenging capacity of DPPH·

2.4.2 对羟基自由基的清除功效 水杨酸能与Fenton反应[15]中生成的·OH作用并产生有色物质。在该体系中加入具有清除·OH能力的物质,可以减少有色物质的生成。故可以通过测定吸光值的变化来判定该物质的清除·OH的能力,从而分析其抗氧化能力。分别以VC、BHT、DCI粗提物和DCI纯化产物的浓度为横坐标,所得吸光度值计算·OH的清除率,为纵坐标,结果见图5。由图5可知,DCI纯化产物对羟基自由基的清除能力大于DCI粗提物,但弱于VC,BHT清除羟基自由基的能力最弱;且在0.1～1 mg·mL-1范围内,随着浓度的上升,VC、BHT和DCI提取物对羟基自由基的清除能力均逐渐增强,且DCI纯化产物的清除能力增加速度最快,结果表明随着DCI含量的增加,其抗氧化活性也逐渐增加。当DCI纯化产物浓度为1 mg·mL-1时,其清除率达到89.49%,与VC的清除率(99.87%)接近。结果显示,DCI提取物对羟自由基有一定的清除能力。

图5 DCI粗提物与纯化产物清除羟基自由基能力的比较Fig.5 Comparison between D-chiro-inositol and its purified product to the scavenging capacity of hydroxyl radical

图6 DCI粗提物与纯化产物清除超氧阴离子能力的比较Fig.6 Comparison between D-chiro-inositol and purified product to the scavenging capacity of superoxide anion

2.4.4 总还原能力的测定 样品的还原力和抗氧化活性有明显相关性,还原力测定依据样品能够提供电子的数目和难易程度,已知抗氧化剂是通过还原自身来清除自由基,物质的还原能力越大,其抗氧化性就越强。因此物质抗氧化活性的大小可以通过测定其还原力的大小来判断[17]。分别以VC、BHT、DCI粗提物和DCI纯化产物的浓度为横坐标,以吸光度值为纵坐标,计算总还原力。由图7知,在0.1～2.0 mg/mL浓度范围内,DCI纯化产物和粗提物的还原能力均随着浓度的增加而增强,表明苦荞DCI提取物具有一定的还原力,其中DCI纯化产物的还原能力强于DCI粗提物和BHT,但低于VC,且随着浓度的升高,DCI纯化产物与粗提物的还原力差距逐渐增大。当DCI纯化产物浓度为2.0 mg/mL时,其吸光度为0.486,而DCI粗提物的吸光值仅为0.314,而VC可以达到0.729,BHT的还原力最弱,其吸光值只有0.258。

图7 DCI粗提物与纯化产物的总还原能力比较Fig.7 Comparison between the D-chiro-inositol and its purified product to total reducing power

3 结论

采用超声波浸提法从苦荞中提取D-手性肌醇,并利用活性炭柱分离纯化,得到纯度较高的DCI提取物,测得苦荞DCI纯化产物中D-手性肌醇的含量为27.26%,是粗提物中DCI含量的211.3倍。高效液相色谱分析结果显示经过活性炭柱纯化后,苦荞DCI提取物中杂质明显减少,色谱峰分离效果较好。体外抗氧化研究结果表明,DCI纯化产物对DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基的清除效果均比DCI粗提物的清除效果好,且具有更好的还原能力。本研究结果表明,DCI提取物具有较好的体外抗氧化活性,其抗氧化能力随着浓度的增大而增强,且DCI纯化产物抗氧化能力大于粗提物,远大于BHT,但低于VC,可以作为一种有效的天然抗氧化剂。本研究结果为深入探究D-手性肌醇抗氧化机制及开发DCI抗氧化保健品及膳食补充剂奠定了一定的理论基础。

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Study on purification and antioxidant activity of D-chiro-inositol from tartary buckwheat

HU Yuan-yuan,YI Ruo-kun,WANG Zhong-ming,NIE Xu-yuan,QIAN Yu,ZHAO Xin*

(Chongqing University of Education,Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food,Chongqing 400067,China)

The D-chiro-inositol was obtained by ultrasonic extraction from tartary buckwheat. The total D-chiro-inositol content was measured by sodium periodate oxidation method. The D-chiro-inositol was purified by activated carbon column. The composition of D-chiro-inositol extractions were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC)method. Moreover,the reducing power of D-chiro-inositol extractions on DPPH,hydroxyl radicals and superoxide anion free radicalinvitrowas measured. Results showed that the content of crude D-chiro-inositol extractions in tartary buckwheat only attained 0.129%,however,the content of purified buckwheat D-chiro-inositol by actived carbon column could be achieved 27.26%. The antioxidant ability of D-chiro-inositol extractions had higher DPPH free radical,superoxide anion free radical and hydroxyl free radical scavenging effects as well as good reducing capacity. Besides,the antioxidant ability of purified product was better than crude extracting from tartary buckwheat.

tartary buckwheat;D-chiro-inositol;activated carbon;HPLC;antioxidant activity

2016-11-28

胡园园(1990-)，女，硕士研究生，助教，主要从事食品加工和植物中天然产物提取分离与功能方面的研究，E-mail:790117529@qq.com。

*通讯作者:赵欣(1981-)，男，博士，教授，主要从事食品生物技术、食品分子营养与功能性食品方面的研究， E-mail:zhaoxin@cque.edu.cn。

重庆市教委科技项目(KJ1714357)；重庆高校创新团队建设计划资助项目(CXTDX201601040)；重庆市工程技术研究中心建设项目(cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027)。

TS210.1

A

1002-0306(2017)14-0082-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.016