范艳丽,韩丽娜,孟雪梅,付丽霞,田建文(.宁夏大学农学院,宁夏银川 7500; .宁夏科技厅,宁夏银川 750000)



枸杞叶黄酮提取物的组成及初步结构表征

范艳丽1,韩丽娜1,孟雪梅1,付丽霞1,田建文2
(1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021; 2.宁夏科技厅,宁夏银川 750000)

本文采用高温乙醇回流法得到一种枸杞叶黄酮提取物,经硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定该提取物的总黄酮含量为347.00 mg/g。采用紫外-可见光谱(UV-Vis)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对其进行初步结构表征,发现枸杞叶黄酮提取物的UV-Vis谱图中含有A-环苯甲酰和B-环肉桂酰系统的特征吸收峰,其FT-IR谱图也显示有C=C、羟基、酚羟基、甲氧基以及甲基等多种特征官能团的振动吸收峰,具有黄酮类化合物的典型结构。通过高效液相色谱(HPLC)测定枸杞叶黄酮提取物中各黄酮类化合物的组成与含量,得出该提取物含有芦丁、绿原酸、槲皮素、咖啡酸、对香豆酸、山奈酚6种黄酮类化合物,含量分别为100.74、0.31、23.59、42.83、2.94、0.08 mg/g,表明提取物是一种富含芦丁、绿原酸和槲皮素的天然黄酮类物质,在天然食品添加剂和功能食品原料等方面具有开发利用价值。

枸杞叶,黄酮类化合物,结构,组成分析

枸杞叶(Lyciumbarbarumleaves)俗称天精草[1],性凉、味苦,因为与枸杞果具有同源性,因此也同样含有丰富的营养成分和生物活性物质[2],具有较高的药用价值。黄酮类化合物是枸杞叶中一类重要的生物活性物质,据报道枸杞叶中的黄酮类化合物含量甚至高于枸杞干果[3]。黄酮类化合物属于植物次级代谢产物,大致可分为黄酮、黄酮醇类、黄烷酮、黄烷酮醇类、花色素、异黄酮、二氢黄酮类和查耳酮等几大类,包括黄芩素、黄芩苷、槲皮素、二氢槲皮素、芦丁、绿原酸、陈皮素、甘草苷、水飞蓟素、葛根素、鱼藤酮、儿茶素、银杏素、山奈酚等化合物[4]。研究发现,黄酮类化合物具有多种生理功能,如清除氧自由基[5]、抑制肿瘤细胞生长[6]、抗炎保肝[7-8]、抗抑郁[9]等。枸杞叶黄酮类化合物的种类和含量依枸杞叶的品种、产地、叶片部位以及采收季节等不同而异,并显示不同的生物学功能[3,10]。枸杞叶是天然黄酮类化合物的良好来源,但长期以来只有少部分被加工成枸杞叶茶,大部分被用于土壤肥料和动物饲料的廉价配料,造成了极大的资源浪费。本文以高温乙醇回流提取枸杞叶黄酮类化合物,采用紫外-可见光谱和傅里叶变换红外光谱对其进行初步结构表征,并通过高效液相色谱测定提取物中黄酮类化合物的组成和含量,为枸杞叶的深加工利用提供可靠的理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞芽茶 食品级,银川育新枸杞种业有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、溴化钾、冰乙酸 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;芦丁、绿原酸、山奈酚、槲皮素、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、甲醇 色谱纯,上海泰坦科技股份有限公司。

WK-600A型高速中药粉碎机 上海新诺仪器设备有限公司;DL-5-A型台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造;JDG-0.2型真空冻干实验机 兰州科近冻干技术有限公司;AL204型电子天平 梅特-勒托利多仪器(上海)有限公司;HH.SY21-Ni6-C电热恒温水浴锅 北京长源实验设备厂;UV200型紫外可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司;UV2450紫外-可见光谱仪 日本岛津公司;TENSR27型红外光谱仪 德国布鲁克公司;KQ5200DE型超声波清洗器 昆山市超生仪器有限公司;AGLENT1100高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞叶黄酮类化合物的提取 用粉碎机将枸杞芽茶粉碎,过60目筛。按照料液比1∶70采用70%乙醇于70 ℃下搅拌提取2 h,重复提取1次,合并提取液,在3000 r/min下离心取上清液,55 ℃下旋转蒸发,浓缩至较小体积后加入石油醚进行脱脂处理,去除叶绿素。用分液漏斗将大部分的石油醚弃除后再进行旋转蒸发,蒸掉石油醚后经真空冷冻干燥,即得到枸杞叶黄酮类化合物[11]。

1.2.2 黄酮含量的测定 芦丁标准曲线制作参考林立等的研究方法[12]。以70%的乙醇溶解芦丁标准品配成浓度为0.20 mg/mL的标准溶液,采用硝酸铝—亚硝酸钠比色法,用紫外分光光度计(510 nm)测定芦丁的含量。精密称取枸杞叶黄酮提取物0.0020 g,用70%乙醇定容在10 mL容量瓶中,得到0.20 mg/mL标准溶液,进行显色测定吸光度,根据回归方程计算出黄酮的浓度,按照公式(1)计算枸杞叶黄酮提取物的黄酮含量。

式(1)

式中:X-黄酮含量(mg/g);Y-根据标准曲线方程计算出的枸杞叶黄酮类化合物的质量浓度(mg/mL);V1-定容后的黄酮的体积(mL);C-配制的黄酮溶液的浓度(mg/mL);V2-测定吸光度时所用的黄酮溶液的体积(mL)。

1.2.3 枸杞叶黄酮类化合物的结构表征

1.2.3.1 紫外-可见光谱检测 精密称取芦丁标准品2mg,枸杞叶黄酮提取物10mg。用70%的乙醇分别定容于10mL容量瓶中,超声10min助溶。用紫外-可见分光光度计在200～800nm内进行紫外光谱扫描,得到枸杞叶黄酮提取物与芦丁标准品的紫外光谱图。

1.2.3.2 红外光谱检测 制备芦丁标准品KBr片,以空白KBr片作为参比,利用傅立叶变换红外光谱仪进行扫描,扫描范围:4000～400cm-1,分辨率4cm-1,扫描次数16的条件下,绘制芦丁标准品红外光谱图;同样条件下绘制枸杞叶黄酮提取物的红外光谱图[13]。

1.2.3.3 高效液相色谱检测 精密称取芦丁标准品1mg、槲皮素标准品2mg、山奈酚标准品1mg、对香豆酸标准品1mg、绿原酸标准品1mg、咖啡酸标准品2mg、阿魏酸标准品1mg,混合均匀,用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中,制作混合标准品储备液[14]。此外,精密称取枸杞叶黄酮提取物10mg于10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。临用前,各样品均经0.22μm有机针式滤器过滤后上样。

色谱条件:InertsilODS-3(C18)色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:A相为甲醇,B相为乙酸-水(1∶100,v/v)溶液;洗脱程序:0～8min,15%～20%A;8～18min,20%～60%A;18～25min,60%A;25～30min,60%～80%A;30～40min,80%A;40～50min,80%～15%A;50～55min,15%A结束。紫外检测波长290nm,柱温30 ℃,流速1mL/min,进样量20μL。以质量浓度(mg/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 提取物总黄酮含量测定

采用硝酸铝—亚硝酸钠比色法测定枸杞叶黄酮提取物的总黄酮含量,得到芦丁标准品的线性回归方程为A=0.0064c+0.0042(式中:A为吸光度,c为被测溶液中芦丁浓度,R2=0.9997)。测定枸杞叶黄酮提取物样品溶液的吸光度,并带入公式(1)计算得到枸杞叶黄酮提取物的黄酮类化合物含量为347.00 mg/g。

2.2 紫外-可见光谱分析

黄酮类化合物具有C6-C3-C6基本结构,这一结构特点使大多数黄酮类化合物的紫外光谱由两个主要的吸收峰组成,一个出现在220～280 nm内(带Ⅱ),另一个在300～400 nm内(带Ⅰ)。一般认为带Ⅱ是由A环的环苯甲酰系统的电子跃迁产生的吸收带,而带Ⅰ则是由B环的环肉桂酰系统的电子跃迁产生的吸收带[15]。各类黄酮因基本母核的差异使带Ⅰ和带Ⅱ的吸收强度有明显的差异,根据带Ⅰ和带Ⅱ的位置和强度,可大致区别黄酮的种类。图1显示,枸杞叶黄酮提取物的图谱特征与芦丁相似,表明枸杞叶黄酮提取物具有黄酮类化合物C6-C3-C6的基本结构。枸杞叶黄酮提取物的主要吸收峰显示为251 nm和328 nm。其中,251 nm的吸收峰说明黄酮提取物中有A-环苯甲酰系统,328 nm的吸收峰说明黄酮类提取物有B-环肉桂酰系统[16]。根据图1中带Ⅱ内251 nm的吸收峰和带Ⅰ内328 nm处的吸收峰及两者吸收强度接近的特征,表明该两处为黄酮类化合物中主要成分的吸收峰[15]。251 nm处吸收峰的峰形宽大、不够尖锐,推测可能原因是提取物在240～280 nm内吸收的物质较多,即A环上取代基的性质和位置复杂。

图1 芦丁标准品与枸杞叶黄酮提取物的紫外光谱图Fig.1 Ultraviolet spectra of rutin and flavonoids extracts from Lycium barbarum leaves

2.3 红外光谱分析

红外光谱是依据待测品吸收谱带的位置、形状、强度及个数,推测官能团,从而有效地鉴定化合物[17]。图2和图3显示,芦丁及枸杞叶黄酮提取物的红外光谱均具有黄酮类化合物的基本特征结构,且黄酮提取物与标准品芦丁的光谱基本一致,表明黄酮提取物中芦丁含量较高。主要表现在以下方面:在官能团区,标准品芦丁在3414 cm-1处,黄酮提取物在3402 cm-1处为分子间氢键O-H伸缩振动,峰形宽大,吸收峰极强,证明有酚羟基或糖上的羟基存在[18];芦丁标准品在2939 cm-1处黄酮提取物在2930 cm-1处有-CH2-伸缩振动,吸收峰的强度较小,说明饱和碳上的氢较少,与芦丁标准品相比黄酮提取物的峰较为尖锐,说明黄酮提取物饱和碳上的氢数量高于芦丁标准品[13];标准品芦丁在1656 cm-1处有C=C的伸缩振动峰,在1602、1506、1456 cm-1处苯环的骨架振动特征吸收(酚类双键伸缩振动)。黄酮提取物在1630、1490、1462 cm-1处出现三个特征峰,且1630 cm-1处峰形较为宽大并不够尖锐,且位置处于1656和1602 cm-1中间,推测1630 cm-1处的峰是C=C的伸缩振动峰和1602 cm-1处苯环的骨架振动峰耦合的结果,1490和1462 cm-1处的峰同样是由于苯环骨架振动产生的(酚类双键伸缩振动);由于标准品芦丁1362、1228 cm-1处和黄酮提取物1406 cm-1处同在1465～1340 cm-1的范围内认定这些是糖类C-H变角振动吸收峰[19-20]。

图2 芦丁标准品的红外光谱图Fig.2 Infrared spectra of rutin

图3 枸杞叶黄酮提取物的红外光谱图Fig.3 Infrared spectra of flavonoids extracts from Lycium barbarum leaves

在指纹区,由于C-O的伸缩振动在1300～1000 cm-1,是该区吸收最强的峰,较易识别,推测标准品芦丁在1037、1141、1207 cm-1和黄酮提取物在1271、1121、1037 cm-1处的吸收峰,极大可能是碳-氧单键的伸缩振动[19],较小可能是部分含H基团的弯曲振动,其中1271 cm-1处可能为芳香-氧基(Ar-O)的伸缩振动峰,1037 cm-1处可能为氧取代基(R-O)的伸缩振动峰;标准品芦丁和黄酮提取物在998～562 cm-1处的吸收峰是苯环上取代基位置引起的,黄酮样品与芦丁的出峰位置不同,表明羟基取代位置不同[13]。

2.4 高效液相色谱测定黄酮类化合物的组成分析

2.4.1 标准曲线回归方程 根据混合标准品的高效液相色谱图,得到各黄酮类化合物的保留时间以及标准曲线回归方程与相关系数,见表1。

2.4.2 枸杞叶黄酮提取物中黄酮类化合物的组成分析 采用高效液相色谱结合外标法测定枸杞叶黄酮提取物中芦丁、槲皮素、山奈酚、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸7种黄酮类化合物的含量,混合标准品与枸杞叶黄酮提取物的高效液相色谱图如图4、图5所示。

图4 混合标准品高效液相色谱图Fig.4 High performance liquid chromatography of mixed standards注:1-绿原酸,2-咖啡酸,3-对香豆酸,4-阿魏酸, 5-芦丁,6-山奈酚,7-槲皮素；图5同。

根据标准曲线计算得出,枸杞叶黄酮提取物中芦丁、绿原酸、槲皮素、咖啡酸、对香豆酸和山奈酚的含量如表2所示,其中阿魏酸未检出。以硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定枸杞叶黄酮提取物的总黄酮含量为347.00 mg/g,因此计算得出枸杞叶黄酮提取物中芦丁、绿原酸、槲皮素、咖啡酸、对香豆酸、山奈酚分别占总黄酮含量的29.03%、12.34%、6.80%、0.85%、0.09%、0.02%,表明芦丁、绿原酸、槲皮素、咖啡酸、对香豆酸和山奈酚这6种黄酮类化合物是枸杞叶黄酮提取物的主要组成,但不是全部组成。而比色法中以芦丁作标准品计算总黄酮含量,也导致其结果与高效液相色谱检测存在差异。此外根据文献报道,Stephen等[21]利用HPLC-DAD-ELS-MS测定枸杞中的黄酮类化合物,除测得芦丁、绿原酸、槲皮素、咖啡酸、对香豆酸、山奈酚外,还检测出了阿魏酸。而Mocan等[22]人同样检测出枸杞及枸杞叶(罗马尼亚)中含有阿魏酸,而芦丁含量最高,绿原酸次之,与本实验研究结果一致。

表1 混合标准品中黄酮类化合物的保留时间和标准曲线回归方程Table 1 Retention time and standard curve regression equation of the flavonoids in mixed standards

表2 枸杞叶黄酮提取物中7种黄酮类化合物的含量Table 2 Contents of 7 kinds of flavonoids in the extracts from Lycium barbarum leaves

图5 枸杞叶黄酮提取物的高效液相色谱图Fig.5 High performance liquid chromatography of flavonoids extracts from Lycium barbarum leaves

注:“-”表示未检出。

3 结论

本文通过高温乙醇回流法提取枸杞叶黄酮类化合物,比色法测定其黄酮含量为347.00 mg/g。紫外-可见光谱检测显示,枸杞叶黄酮提取物具有黄酮化合物C6-C3-C6的基本骨架,即峰带Ⅰ(300～400 nm肉桂酰基)及峰带Ⅱ(220～280 nm,苯甲酰基)。红外光谱扫描显示,枸杞叶黄酮提取物中存在羟基的伸缩振动和弯曲振动、苯环的骨架振动及苯环上C-H面外变形振动、C=C的伸缩振动、糖苷C-H的变角振动、糖类饱和C-H变角振动以及碳-氧单键的伸缩振动,推测枸杞叶黄酮提取物的结构中含有羟基、酚羟基、甲基、甲氧基、双键等官能团。高效液相色谱分析表明,枸杞叶黄酮提取物中含有芦丁、绿原酸、槲皮素、咖啡酸、山奈酚和对香豆酸6种黄酮类化合物,其含量分别为100.74、0.31、23.59、42.83、0.08、2.94 mg/g。本实验结果表明,高温乙醇回流提取法能够得到较高含量的枸杞叶黄酮提取物,且该提取物富含芦丁和绿原酸,是一种具有开发利用价值的天然功能食品原料。

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Composition analysis and preliminary structural characterization of the flavonoids fromLyciumbarbarumleaves

FAN Yan-li1,HAN Li-na1,MENG Xue-mei1,FU Li-xia1,TIAN Jian-wen2

(1.College of Agricultural,Ningxia University,Yinchuan 750021,China; 2.Ningxia Science and Technology Department,Yinchuan 750000,China)

A flavonoids extract was obtained fromLyciumbarbarumleaves by ethanol refluxing method in high temperature,and its total flavonoids content was 347.00 mg/g detected by aluminum nitrate-sodium nitrite colorimetric method. The preliminary structural characterization of the flavonoids extract were determined by UV-visible spectroscopy(UV-Vis)and Fourier transform infrared spectroscopy(FT-IR). The results showed that the flavonoids extract inLyciumbarbarumleaves contained A-benzoyl ring and B-cinnamoyl ring structures in UV-Vis spectra,and had main characteristics of flavonoids functional groupsincluding C=C group,a hydroxyl group,a phenolic hydroxyl group,methoxy and methyl groups in FT-IR spectra,which indicated that the extract fromLyciumbarbarumleaves had the typical structure of flavonoids. The composition of flavonoids in the extract was analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC). The result showed that rutin,chlorogenic acid,quercetin,caffeic acid,p-coumaric acid and campherol existed in the flavonoids extract. The contents of them were 100.74,0.31,23.59,42.83,2.94 and 0.08 mg/g respectively,indicating that the extract was a kind of natural flavonoids substances rich in rutin,chlorogenic acid and quercetin,and had the value of development and utilization in natural food additives and functional food materials.

Lyciumbarbarumleaves;flavonoids;structure;composition analysis

2016-12-12

范艳丽(1980-)，女，博士，副教授，研究方向:食品营养与特色农产品加工,E-mail：fanyanli_fyl@163.com。

国家自然科学基金资助项目(31660438)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)14-0046-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.010