王世成,王 莹,张 红,李国琛,王颜红(中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳市食品安全检测与控制技术重点实验室,辽宁沈阳 110016)



北虫草中虫草素的NIR快速定量测定

王世成,王 莹,张 红,李国琛,王颜红*
(中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳市食品安全检测与控制技术重点实验室,辽宁沈阳 110016)

应用近红外光谱(NIR)和偏最小二乘法(PLS),建立了北虫草中虫草素的定量分析校正模型。分别采集北虫草子实体的近红外光谱图,应用TQ化学计量学分析软件,对不同化学计量学处理方法进行了比较,并对光谱区域,光谱预处理方法,主成分因子数进行筛选。依据预测效果确定了最佳的校正模型,虫草素含量的预测结果与HPLC检测结果的相关系数为0.9919,校正模型的定标均方差(RMSEC)为102 mg/kg、预测均方差(RMSEP)为281 mg/kg。本方法操作简便,快速无损,可用于北虫草中虫草素含量的快速检测。

近红外光谱,北虫草,虫草素,偏最小二乘法(PLS),主成分回归(PCR)

北虫草[Cordycepsmilitaris(L.)Link]又名北冬虫夏草、蛹虫草,与冬虫夏草同属异种。人工培植的北虫草含有虫草素(即3-脱氧腺苷)、虫草酸、虫草多糖、腺苷、超氧化物歧化酶(SOD)等多种特有的活性成分[1]。2009年国家卫生部发布公告,批准北虫草为新资源产品。其中的虫草素作为北虫草的最主要特征成分,具有广谱的抗菌活性,有抑制肿瘤、抗病毒、免疫调节作用[2-4];虫草素在北虫草中的含量比冬虫夏草高很多,约为后者的数倍甚至10倍[5]。作为评价北虫草的关键指标,虫草素测定通常采用高效液相色谱法[6-8]、毛细管电泳-质谱法[9]、高效液相色谱-质谱法[10]和分光光度法[11]等,但是上述方法测定的时间较长,有时不能满足产品快速检测的需要。

近红外光谱作为一种重要的快速检测手段,已经在北虫草中腺苷、虫草酸、多糖和蛋白质等活性成分及食用农产品的有效成分快速检测中得到广泛应用[12-15]。但是,采用近红外光谱测定虫草素含量的方法还未见报道。为此,本文应用近红外光谱技术,建立了北虫草子实体中虫草素的快速检测方法,为北虫草素的质量评价提供了一个快速、简便的分析手段。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

表1 北虫草样品中虫草素含量统计分析Table 1 Statistical analysis of cordycepin contents in Cordyceps militaris

北虫草样品 为市场采购和企业提供的北虫草子实体干燥样品,共计31份,在60 ℃干燥箱中烘干12 h,粉碎后过80目筛备用;虫草素标准品 上海安谱科学仪器有限公司,含量99.9%;乙腈 为色谱纯,Merck公司;实验用水 均为超纯水;其他试剂 均为分析纯。

Nicolet 6700红外光谱仪 装配智能积分球附件、样品旋转器、InGaAs检测器、配有OMNIC8.0光谱采集软件和TQ8.0分析软件，美国Thermo Fisher公司;2695液相色谱仪 配有996二极管阵列检测器,MassLynx V4.1工作站，美国Waters公司;KQ-250B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Milli-Q超纯水仪 Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 北虫草中虫草素含量的化学值测定 参照NY/T2116-2012《虫草制品中虫草素和腺苷的测定 高效液相色谱法》,采用HPLC测定。

1.2.2 图谱的采集 采集方式:积分球漫反射,扫描次数32次,扫描范围:4000～10000 cm-1,分辨率4 cm-1。测试前,将自动旋转式样品杯擦拭干净,确保样品杯中装入2/3体积以上北虫草干粉样品,压实,通过OMNIC8.0 软件控制光谱仪扫描,每个样品扫描3次,取平均谱作为该样品的近红外光谱。

1.2.3 波数选择和近红外光谱图的预处理方法 将31个北虫草样品分成2组,一组21个样品作为校正集用于建立校正模型,另外10个样品作为验证集用于模型验证。利用TQ8.0分析软件进行回归分析处理,剔除高频区和低频区的无效光谱,并对光谱的处理采用了无光谱预处理、一阶导数(1st)、二阶导数(2st)、标准正态变量校正(SNV)、多元散射校正(MSC)、Savitzky-golay平滑(Sav)、Norris平滑(Nor)以及上述预处理方式的校正+导数+平滑组合处理等方法。以校正模型的相关系数(r)、均方根误差(RMSEC)和预测均方差(RMSEP)作为衡量标准,选择建模最佳波数段和最佳预处理方式。

1.2.4 校正模型的建立及评价 采用TQ8.0分析软件,分别对采集的近红外图谱进行数据预处理,比较了偏最小二乘法(PLS)和主成分回归分析(PCR)的化学计量学处理方式,同时采用内部交叉验证和验证集样品的外部验证方式,由定标均方差(RMSEC)、预测均方差(RMSEP)、内部交叉验证均方差(RMSECV)及回归值与实测值的相关系数r来评价模型质量。

2 结果与讨论

2.1 样品虫草素含量的数据分析

对获得的31个北虫草中虫草素的HPLC分析结果进行统计分析,结果见表1。由分析结果可以看出,样品的虫草素最小含量为351 mg/kg,最高含量为3303 mg/kg,平均值1529.5 mg/kg,标准偏差为777.8 mg/kg,含量分布范围近10倍区间。校正集和验证集样品的平均值和偏差分别为1549.3、822.8，1487.7、713.8 mg/kg,平均值相近,偏差均较大,说明用于近红外建模的校正集和验证集样品虫草素含量值分布能够涵盖正常北虫草中的虫草素含量范围,且数据较分散,多态性比较丰富,并满足建模的要求。

2.2 光谱预处理

图1是未经预处理的光谱图(4000～10000 cm-1),由图可见,样品的吸收峰主要集中在4000～7000 cm-1范围内。在红外光谱测定过程中,由于受仪器噪声、空气温湿度、样品颗粒均匀程度、试样量不均匀等诸多因素影响,可能会使红外谱图的某些信息被噪声掩盖或干扰,基线发生倾斜或漂移,因而在建模时需要对采集的红外谱图进行预处理。对于样品不同组分之间的相互干扰导致红外光谱谱线重叠以及基线漂移和倾斜的现象,可采用求导数的方法进行消除,其中常用的是一阶导数和二阶导数。谱图中的高频噪声干扰可采用平滑的方式去除或减少;由于仪器背景、样品粒度和其它因素的影响,出现基线漂移和倾斜的现象,可采用基线校正有效地消除。通常情况下,如果采用导数处理的光谱图,就不需做基线校正了。样品颗粒分布不均所产生的散射对光谱的影响可采用多元散射校正(MSC)或标准正态变量校正(SNV)消除。

图1 样品的近红外光谱Fig.1 Near infrared spectroscopy of samples

为此,在TQ8.0软件推荐的光谱范围内,对采集的近红外光谱进行了不同处理方法的比较。相关系数(r)越接近1,RMSEC和RMSEP越小,模型的预测结果越精确,光谱预处理方法也就越优。首先比较两种校正方法,结果表明,标准正态变量校正(SNV)优于多元散射校正(MSC)的处理效果。表2列出了采用标准正态变量校正(SNV)后,不同光谱处理方法：一阶导数(1st)、二阶导数(2st)、Savitzky-golay平滑(Sav)、Norris平滑(Nor)、以及导数+平滑的组合处理对模型的影响。由表2看出,光谱的多种预处理方式中,导数的处理对PLS方法建模具有明显的正向影响,对PCR呈现负向影响;二阶导数的Nor平滑处理效果好于Sav平滑处理。

表2 光谱预处理的影响Table 2 Effect of spectral pretreatment

2.3 波数段的选择

北虫草中含有虫草酸、虫草素、多糖、腺苷、蛋白等成分,其中虫草素(3-脱氧腺苷)分子中主要含氢原子的基团有亚甲基、次甲基、羟基、氨基等。近红外光谱的吸收规律表明[16],亚甲基的C-H(不)对称伸缩振动特征吸收峰出现在2843～2963 cm-1处,一级倍频峰出现在5170～5757 cm-1的近红外区附近;烯烃的C-H一级倍频峰出现在5455～6079 cm-1;O-H的伸缩振动基频峰位于2940～4000 cm-1,其一级倍频峰出现在4545～6671 cm-1;N-H的一级倍频峰出现在6173～6658 cm-1处。采用TQ8.0分析软件筛选的谱图波数区域基础上,依据预测模型的评价指标,并结合虫草素的吸收峰位置,对校正模型的波数范围进行了优化。最后选取在4500～5300、6300～6700、6910～6920 cm-1范围内的共计3个区段作为校正模型的波数范围。图2为模型选定的近红外吸收图谱在4000～6000 cm-1区间的二级导数图,由图2可见,该区域内的5190、5060、4865、4605 cm-1附近均有明显的吸收峰。这4个峰均处在亚甲基C-H 振动一级倍频吸收和O-H的一级倍频吸收区域。

图2 典型区域光谱的二阶导数图谱Fig.2 2st derivative of typical spectrum

2.4 最佳主成分数的确定

在采用化学计量学建立校正模型时,建模选取的最佳主成分数是影响模型质量的关键。目前使用较多的是通过计算内部交叉验证均方差(RMSECV)的方法来确定最佳主成分数[17]。RMSECV值越小,说明模型的预测能力越好。本模型在采用PLS统计方法时,主成分少于2时,RMSECV随主成分的增加而增加,而当主成分在2～5之间,随着主成分数的增加而减小,在5以后随着主成分的增加又呈增加,RMSECV最小值对应的主成分数为5,此时主成分数最佳。

2.5 模型的建立

一个好的校正模型应具有较高的相关系数,较低的RMSEC、RMSEP值;同时,RMSEC和RMSEP之差也要相对较小,才能保证模型预测结果具有较高精度。应用TQ8.0分析软件,在图谱预处理条件优化的基础上,综合评价了PLS和PCR化学计量学方法构建校正模型结果,虽然PCR建模方法中模型的定标均方差(RMSEC)较小(4.8～254),但模型推荐的最佳主成分因子数较高,均为19,易出现过拟合和产生共线性,影响模型的预测精度和稳定性。PCR方法的预测均方差(RMSEP)明显大于PLS方法,且比较两种处理方法的RMSEP与RMSEC的差值,PCR方法明显大于PLS方法。PLS模型具有最高的相关系数,较低的RMESC值和RMSEP值。综合分析,PLS方法优于PCR化学计量学处理方法。

所以最终确定,图谱采用标准正态变量校正(SNV)+二阶导数+Nor平滑的处理方式,建模采用PLS化学计量学方法,获得较理想的校正模型。模型的相关系数r为0.9919,RMSEC和RMSEP分别为102和281。获得的校正模型结果见图3所示。

图3 定量模型预测值与实测值的相关性(上图)及偏差分布(下图)Fig.3 Correlation(up)and difference(down) between predicted values and actual ones of the models

3 结论

采用漫反射方法采集北虫草子实体的近红外光谱,在4500～5300、6300～6700、6910～6920 cm-1范围内,应用TQ8.0分析软件的PLS方法建立了北虫草中虫草素的定量预测校正模型。虫草素含量的模型预测值与HPLC实测值具有很好的相关性,相关系数为0.9919,预测模型的RMSEC和RMSEP分别为102 mg/kg和281 mg/kg,模型具有良好的定量预测效果。利用该模型能够定量测定北虫草中虫草素的含量,建立的方法是一个快速、简便、有效的虫草素检测方法,可用于北虫草中虫草素含量的快速检测。

[1]万朋,高俊涛,吕世杰. 蛹虫草化学成分及药理作用研究进展[J]. 上海中医药杂志,2015,49(6):95-97.

[2]Hardeep S Tuli,Sardul S Sandhu,A K Sharma.Pharmacological and therapeutic potential of Cordyceps with special reference to Cordycepin[J].3 Biotech,2014,4(4):1-12.

[3]余伯成,唐永范,唐亮,等. 虫草素的药理作用研究进展[J]. 现代药物与临床,2011,26(5):349-352.

[4]胡贤达,岳颖,武鹏,等.虫草素药理作用研究及展望[J].

中国生化药物杂志,2015,35(12):180-182.

[5]钟石,李有贵,陈诗,等.人工培养蛹虫草与冬虫夏草的主要活性成分比较[J]. 蚕业科学,2009,35(4):831-836.

[6]李辰,闫爱国,蔡春燕,等. 蛹虫草及其培养残基中腺苷和虫草素含量的快速测定[J]. 色谱,2012,30(7):711-715.

[7]袁蜜,乐昕,徐鲁荣,等. 高效液相色谱法同时测定蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量[J]. 食品科学,2013,34(14):306-310.

[8]F Q Yang,J Guan,S P Li.Fast simultaneous determination of 14 nucleosides and nucleobases in cultured Cordyceps using ultra-performance liquid chromatography[J].Talanta,2007,73(3):269-273.

[9]F Q Yanga,L Geb,J W Hong Yongb,et al.Determination of nucleosides and nucleobases in different species of Cordyceps by capillary electrophoresis-mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2009,50(6):307-314.

[10]黄兰芳,郭方遒,梁逸曾,等. HPLC-ESI-MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量[J]. 中国中药杂志,2004,8(8):49-51.

[11]李泳,余潮彬,张兆霞,等. 紫外可见分光光度法测定虫草素含量[J]. 广东化工,2012,39(11):186-187.

[12]王迪,张嫒莉,孟庆繁,等. 近红外光谱在快速测定蛹虫草有效成分含量中的应用[J]. 光学学报,2009,29(10):2795-2799.

[13]罗曦,吴方喜,谢鸿光,等.近红外光谱的水稻抗性淀粉含量测定研究[J]. 光谱学与光谱分析,2016,36(3):697-701.

[14]徐文杰,刘茹,洪响声,等. 基于近红外光谱技术的淡水鱼品种快速鉴别[J]. 农业工程学报,2014,30(1):253-261.

[15]叶正良,虞科,程翼宇.一种基于小波变换的近红外化学指纹图谱分析方法[J]. 高等学校化学学报,2007,28(3):441-444.

[16]陆婉珍.现代近红外光谱分析技术[M]. 北京:中国石化出版社,2007:14-26.

[17]蔡佳良,郭念欣,黄洁燕,等.运用近红外光谱法建立广藿香中百秋李醇的定量模型[J].中国中药杂志,2012,37(14):2113-2116.

Rapid determination of cordycepin inCordycepsmilitaris
by near-infrared spectroscopy

WANG Shi-cheng,WANG Ying,ZHANG Hong,LI Guo-chen,WANG Yan-hong*

(Institute of Applied Ecology,the Chinese Academy of Sciences,Shenyang Key Laboratory of Detection and Control Technology of Food Safety,Shenyang 110016,China)

The quantification model of determining the content of cordycepin inCordycepsmilitariswas established by using near-infrared spectroscopy(NIR)combined with a partial least square(PLS)method. The comparison of principle component regression(PCR)and PLS,selection of spectroscopy wavenumber region and principal component factor number were studied.The best model was selected according to the prediction effect. The correlation coefficients of prediction,the root mean square error of calibration(RMSEC)and the root-mean-square error of prediction(RMSEP)of the model were 0.9919,102 mg/kg,281 mg/kg respectively. The proposed methods are simple,convenient,fast,and can be applied for detection of cordycepin inCordycepsmilitaris.

near-infrared spectroscopy(NIR);cordycepin;Cordycepsmilitaris;partial least square(PLS);principal component regression(PCR)

2016-11-23

王世成(1966-)，男，硕士，研究员级高工，主要从事光谱与色谱检测技术及天然产物研发方面的研究，E-mail：wangsc@iae.ac.cn。

*通讯作者:王颜红(1963-)，女，硕士，研究员，主要从事检测技术与食品安全风险评估方面的研究，E-mail:wangyh@iae.ac.cn。

国家重点研发计划(2016YFD0401201)；沈阳市科技计划项目(F14-198-4-00)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)14-0016-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.004