陈立红，郝 鹏，巢玉娣，邵秋阳，陈方进，章永坚，习海波

褪黑素受体1A基因rs13140012位点T基因多态性增加特发性草酸钙结石易感性风险

陈立红1，郝 鹏2，巢玉娣1，邵秋阳1，陈方进1，章永坚1，习海波3

（1.都昌县人民医院泌尿外科，江西 九江 332600；2.武汉市普爱医院泌尿外科，湖北 武汉 430032；3.南昌大学第一附属医院泌尿外科，江西 南昌 330006）

目的 研究褪黑素受体1A基因rs13140012位点A/T多态性与特发性草酸钙结石的关系。方法 根据纳入和排除标准，在江西省汉族人群内，进行相关试验研究。采用RT-PCR技术监测研究对象外周血中MTNR1A的基因多态性。结果 共纳入260例研究对象，其中特发性草酸钙结石（ICOS）患者115例和对照组145例。试验组与对照组两组基线可比：性别、年龄和体重指数差异无统计学意义。SNP rs13140012位点A等位基因频率在ICOS组和健康对照组分别为：86%VS 95.2%。T等位基因频率分别为14%VS 4.8%。ICOS和健康人群相比，SNP-A与SNP-T的基因频率有显著的差异（P＜0.001）。结论 MTNR1A基因rs13140012位点A/T与ICOS易感性存在相关性，T是特发性草酸钙结石的危险因素。

尿石症；特发性草酸钙结石；褪黑素受体；单核苷酸多态性；易感性

特发性草酸钙结石（Idiopathic calcium oxalate stones，ICOS）是多基因疾病，ICOS的发生、发展及复发，与多个基因存在相关性，并受到基因-基因之间和基因-环境的交互作用所影响[1-3]。目前研究发现褪黑素受体1A（MTNR1A）基因与多种疾病相关，在早期研究中发现，其可能影响着泌尿系结石的发生。本研究拟对MTNR1A基因rs13140012位点A/T多态性与ICOS易感性的关系进行探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 试验通过医院医学伦理协会论证。（1）ICOS组：纳入标准，①在本中心就诊，完善相关检查，临床明确诊断为泌尿系结石，接受药物排石或手术治疗；②所取得的泌尿系结石标本，采用结石红外光谱分析系统进行结石成分分析，明确诊断为草酸钙结石（一水草酸钙或二水草酸钙）；③研究对象知情同意并签署相关知情同意书。排除标准，①有家族遗传性疾病；②糖尿病及其他内分泌系统疾病；③其他影响泌尿系结石慢性病：慢性肠道疾病、甲状旁腺功能亢进、尿路梗阻等[4]。（2）健康对照组：纳入标准，①健康体检成人，年龄大约18周岁；②知情告知，签知情同意书。排除标准：①家族遗传性疾病；②糖尿病及其他内分泌系统疾病；③其他影响泌尿系结石慢性病：如尿道肿瘤、尿道梗阻、甲状旁腺功能亢进症、慢性结肠炎。最终共有260例研究对象纳入研究，其中ICOS患者115例，健康对照人群145例。两组人群性别、年龄及体重指数比较差异无统计学意义，具有可比性。见表1。

表1 试验组与对照组年龄、性别和体重指数比较

1.2 方法

1.2.1 结石成分使用结石红外光谱分析系统（天津蓝莫德公司），经手术或药物排石后获取结石标本，取结石标本的核心部分进行成分分析。

1.2.2 MTNR1A基因rs13140012位点A/T多态性分析 （1）血DNA提取：采用传统Chelex-100方法提取外周血DNA。检测DNA浓度及OD260/280值；最终所有DNA标本稀释至20-50ng/μL，-20℃储存备用。

（2）PCR扩增：生工生物工程（上海）有限公司合成引物：

上游引物为：MTNR1A rs13140012-A(F)5'GCGGGCCTAAGTAAATCTACAGGA 3'

MTNR1A rs13140012-T(F) 5' GCGGGCAGGGCGGCCTAAGTAAATCTAC AGGT 3'

下游引物为：

MTNR1A rs13140012(R)5'AGGATTGCAGTGTGGGATTTCTA 3' SYBR Green PCR反应体系：

体积（µL）10 1 0.25 0.25 0.25 6反应条件：成分Just SYBR Premix DNA引物SNP-UP-A(5µM) SNP-UP-T(5µM) SNP-Low(5µM) DEPC-treated water 95℃10 min 35 95℃ 5 s 58℃ 15 s 72℃ 15 s预变性循环数变性退火延伸

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件分析。计量资料以“x±s”表示，进行独立样本t检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测 目的基因扩增后，根据溶解曲线，确定基因分型：MTNR1A基因rs13140012位点A/T。见图1、图2。

2.2 MTNR1A基因rs13140012位点A/T多态性与结石易感性相关性分析 MTNR1A基因rs13140012位点A基因和T基因，在ICOS组与健康人群分布差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 ICOS与对照组中的A/T等位基因频率

3 讨论

泌尿系结石是最常见的泌尿外科疾病之一，严重的影响人类健康和生活质量。世界范围内其发病率为2%～20%[5]。所有的泌尿系结石中，60%～80%为含草酸钙的结石。临床上，少数草酸钙结石是由单基因遗传引起的，还有一部分是继发性结石（如胃肠道疾病引起），其余的绝大多数草酸钙结石是ICOS[6]。目前大多数学者认为：ICOS是多基因遗传疾病，其发生、发展和复发与多个基因的SNP存在相关性，并且受到基因-基因之间、基因-环境之间得交互作用影响。目前已报道的与泌尿系结石发病相关的一些基因包括：如血管内皮生长因子（VEGF）[7]、骨桥蛋白基因（OPN）[8]、尿激酶[3]等。这些SNP的发现为结石的形成机制研究提供了基因水平的证据。

褪黑素（MEL）是主要是由位于下丘脑的松果体分泌的吲哚胺类激素，具有重要生理功能的激素；有少部分MEL由视网膜分泌。目前，已经在多个物种的多个组织中检测到，并且能维持明显的昼低夜高的节律变化。不仅可以提高机体免疫能力，也有报道认为MEL是一种高效的自由基清除剂和抗氧化剂，这些生理功能的发现，提示可能于泌尿系结石形成有关。在哺乳动物体内体内，MEL受体有两型：α细胞中的MEL受体1A（MTNR1A）和β细胞中的MEL受体1B（MTNR1B）；MTNR1A的分布比MTNR1B更为广泛，两个受体介导了褪黑素不同生理活性。人类MTNR1A基因位于染色体4q53.1，有两个外显子，编码350个氨基酸的蛋白。目前研究认为：褪黑素的主要生理学功能是由MTNR1A基因介导的[9-10]。

随着MEL及MTNR相关作用机制的研究进展，其生理功能逐渐被学者所认识。MTNR1A基因的多态性和性状关联分析是目前研究的重点：目前研究认为MTNR1A基因的改变与某些先天性疾病的发生有关，或导致后天性疾病的发生率增加，如：睡眠紊乱、精神分裂、多囊卵巢及糖尿病等[11-13]。与目前关于MTNR1A基因多态性与泌尿系结石相关性研究较少。本研究通过对江西省人群范围内，对比ICOS和健康人群中MTNR1A基因SNP rs13140012多态位点在等位基因频率上的差异，探讨MTNR1A基因与特发性草酸钙结石的相关性，拟为ICOS的发生、发展及治疗提供理论学依据。我们的目前研究结果发现：ICOS组，rs13140012多态位点T基因携带者的患病风险率明显高于A基因，说明MTNR1A基因可能是特发性草酸钙结石的易感基因，与ICOS的易感性存在相关性。Esposito Teresa[14]等与2012年也报道了想类似的研究结果。

由于客观条件限制，本研究最终纳入260例研究对象，能从一定程度上发现相关情况，但尚需在后续研究中进行更大范围的人群普查，以扩大研究结论和增强验证强度。另外，由于泌尿系结石初发和复发人群存在差异性，故基因可能存在部分差异，后期需进行分组研究，以提高论证依据，用于病因预防及治疗。本研究结果发现MTNR1A基因rs13140012多态位点A/T多态性和特发性草酸钙结石易感性的关系，在一定程度上为泌尿系结石的研究提供了基因水平的证据。随着MEL和MTNR的不断研究进展，必定会为草酸钙结石的精准治疗提供了新的方向和治疗靶点。但此次报道仅为我们的初步研究结果，进入临床应用尚需要我们的深入研究。

[1] 傅龙龙,王共先,傅斌.泌尿系结石病因学的研究进展[J].天津医药,2012,40（9）:965-969.

[2] Telci D,Dogan AU,Ozbek E,et al.KLOTHO gene polymorphism of G395A is associated with kidney stones[J].American journal of nephrology,2011,33(4): 337-343.

[3] 习海波,傅龙龙,王共先,等.尿激酶3’-UTR基因多态性与特发性草酸钙结石易感性的关系[J].山东大学学报(医学版), 2013,51(5):105-107.

[4] Nouvenne A,Meschi T,Guerra A,et a1.Diet to reduce mild hyperoxaluria in patients with idiopathic calcium oxalate stone formation:a pilot study[J].Urology,2009,73(4):725-730.

[5] Indridason OS,Birgisson S,Edvardsson VO,et al. Epidemiology of kidney stones in Iceland:a population-based study[J].Scand J Urol Nephrol,2006,40: 215-220.

[6] Worcester EM,Coe FL.Calcium kidney stones[J].New EngIand J Med,2010,363(10):954-963.

[7] Stevens A,Soden J,Brenchley PE,et al.Haplotype analysis of the polymorphic human vascular endothelial growth tactor gene promoter Cancer Res,2003,63:8l2-816.

[8] Gögebakan B,Igci YZ,Arslan A,et al.Association between the T-593A and C6982T polymorphisms of the osteopontin gene and risk of developing nephrolithiasis[J].Archives of medical research,2010,41(6):442-448.

[9] Song Y,Ayre EA,Pang SF.[125I]iodomelatonin binding sites in mammalian and avian kidneys[J].Biol Signals,1993,2:207-220.

[10]Song Y,Tam PC,Poon AM et al.2-[125I]iodomelatonin binding sites in the human kidney and the effect of guanosine 5’-O-(3-thiotriphosphate)[J].J Clin Endocrinol Metab,1995,80:1560-1565.

[11]Ebisawa T,Kajimura N,Uchiyama M,et al.1999.Alleic variants of human melatonin 1a receptor:Function and prevalence in subjects with circadian rhythm sleep disorders[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,262(3):832-837.

[12]Park HJ,Park JK,Kim SK,et al.Association of polymorphism in the promoter of the melatonin receptor 1A gene with schizophrenia and with insomnia symptoms in schizophrenia patients[J].Journal of Molecular Neuroscience,2011,45(2):304-308.

[13]Li C,Qiao B,Zhan Y,et al.2013.Association between genetic variations in MTNR1A and MTNR1B genes and gestational diabetes mellitus in Han Chinese women[J].Gynecologic and Obstetric Investigation,76 (4):221-227.

[14]Esposito T,Rendina D,Aloia A,et al.The melatonin receptor 1A(MTNR1A)gene is associated with recurrent and idiopathic calcium nephrolithiasis[J]. NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION,2012,27(1):210-U260.

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.22.034

2016年九江市科技局课题19号

习海波，E-mail：13870834578@163.com