周东 刘贞 刘丽 许鹏程 郑银英

（石河子大学生命科学学院 石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子 832003）

新疆辣椒CMV基因组序列分析与CP基因多克隆抗体制备

周东 刘贞 刘丽 许鹏程 郑银英

（石河子大学生命科学学院 石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子 832003）

克隆新疆辣椒LJ-10 CMV基因组片段，并进行序列分析，构建CMV CP基因的原核表达载体，并制备CP基因的多克隆抗体。利用RT-PCR技术，克隆新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1（3 357 nt）、RNA2（3 042 nt），RNA3（2 212 nt）全基因组片段，与GenBank上登陆的CMV亚组IA、亚组IB、亚组Ⅱ分离物进行序列分析和系统进化树分析。将LJ-10 CMV CP基因克隆到原核表达载体pET-22b中，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达纯化，以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子，制备CMV特异性抗血清，并进行间接ELISA和Western blotting分析。结果显示，成功克隆了新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1、RNA2、RNA3全基因组片段，序列分析及系统进化树分析表明，该分离物属于CMV亚组IB。成功构建了LJ-10 CMV CP基因的原核表达载体pET-CMV-CP，在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导获得了与预期大小一致的分子量约为27 kD的重组蛋白，制备了CMV的特异性抗血清。间接ELISA和Western blotting分析表明，制备的抗血清效价为1：500-1 000。新疆辣椒LJ-10 CMV分离物属于CMV亚组IB，成功构建了LJ-10 CMV CP基因的原核表达载体，制备了相应的多克隆抗体。

黄瓜花叶病毒；序列分析；外壳蛋白；原核表达；蛋白质印迹检测

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是目前发现的寄主范围和分布最广、危害最严重的病毒之一，能侵染85科365属1 000多种植物［1］，通过蚜虫、种子、菟丝子和汁液摩擦接种等多种途径传播［2］。

CMV是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员，基因组为三分体单链正义RNA［1］。RNA1编码1a蛋白；RNA2编码2a蛋白，其亚基因组RNA4A 编码病毒沉默抑制子2b 蛋白［3，4］，1a和2a蛋白均参与病毒的复制［5，6］；RNA3编码3a移动蛋白（Movement protein，MP），参与病毒移动［7，8］，其亚基因组RNA4编码外壳蛋白（Coat protein，CP），决定病毒粒子的移动及病毒的蚜传活性［9，10］。CMV依据基因组RNA3的5′端非编码区和CP基因序列，划分为CMV I和CMV II组［1］。CMV I进一步划分为CMV IA和CMV IB亚组，其亚组间核苷酸序列相似性为92%-95%［11］。有些CMV还携带基因组大小为332-405 nt单链、线状卫星RNA（Satellite RNA，satRNA）［12］。

CMV在我国新疆番茄、辣椒、南瓜、甜菜等蔬菜中均有发生，且不同寄主的CMV均归为CMV IB亚组，然而辣椒的CMV在血清学和CP序列中存在较大的变异［13-15］。目前，不同地域的西番莲、加工番茄、烟草等植物中的CMV分离物的CP基因通过原核表达，制备了高特异性抗体，从而为快速地检测不同地域、不同寄主中的CMV奠定了基础［16，17］。因此本研究从感染CMV的辣椒中提取dsRNA，利用RT-PCR技术克隆了RNA1、RNA2、RNA3全基因组片段，并通过原核表达CP基因制备基因工程多克隆抗体，以期为我国新疆CMV高效、快速血清学检测提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料

2012年从石河子蔬菜研究所采集感染CMV，编号为LJ-10辣椒样本提取dsRNA［18］。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3），原核表达载体pET-22b为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物 根据GenBank登录CMV株系或分离物序列设计引物，由上海生工生物技术有限公司合成（表1）。

表1 扩增CMV RNA1、RNA2、RNA3的RT-PCR引物

1.2.2 CMV基因组RT-PCR扩增 从LJ-10样本上提取的dsRNA为模板逆转录合成cDNA，具体反应体系为：dsRNA 3 μL、随机引物2 μL、DEPC-H2O 5 μL混匀，95℃ 10 min，立即冰浴 2-5 min。继续加入5 μL 5 × AMV buffer、0.3 μL RNase Inhibitor（40 U/μL）、0.7 μL AMV（10 U/μL）、3 μL 2.5 mmol/L dNTPs、6 μL DEPC-H2O， 为25 μL体系。 混匀，42℃ 60 min，最后70℃ 15 min，-20℃保存备用。

以cDNA为模板进行PCR扩增，回收、纯化预期大小的PCR产物后，连接至pGEM-T Easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB（含 50 μg/L氨苄青霉素）培养基上37℃培养14-16 h，挑取单菌落，提取质粒DNA，酶切鉴定重组质粒正确后，由上海英骏生物技术有限公司北京测序部公司进行序列测定。

1.2.3 序列分析 用DNASTAR软件进行序列相似性比较，用遗传进化分析软件MEGA5.0邻接法（Neighbor- Joining）计算序列间的遗传距离。Bootstrap为1 000重抽样统计评价各枝的置信度，同时，进化树构建中引入花生矮化病毒（Peanut stunt virus，PSV）ER（U15730）株系为外群。所用分离物如下：CMV亚组IA：Fny（D00356、D00355、D10538）；Leg（D16403、D16406、D16405）；Mf（AJ276479、AJ276480、AJ276481）；Y（D12537、D12538、D12499）；O（*、D10209、D00385）。CMV亚组IB：Nt9（D28778、D28779、D28780）；Tfn（Y16924、Y16925、Y16926）；IX（U20220、U20218、U20219）；SD（AF071551、D86330、AB008777）；IA（AB042292、AB042293、AB042294）；Phy（DQ402477、DQ412731、DQ412732）。CMV亚 组II：Q（X02733、X00985、M21464）；Ly（AF198101、AF198102、AF198103）；S（Y10884、Y10885、U37227、AF063610）；LS（AF416899、AF416900、AF127976）；Trk7（AJ007933、AJ007934、L15336）。1.2.4 原核表达蛋白纯化与多克隆抗体制备 根据辣椒上获得的CMV RNA3 序列设计合成CMV S/CMV A引物，扩增CP基因，之后利用Noc I/BamH I双酶切，将LJ-10 CP基因重组到原核表达载体pET-22b，构建重组质粒pET-CMV CP，转化E. coli BL21（DE3）感受态细胞，以空载体pET-22b为对照，37℃ 1 mmol/L IPTG诱导2-6 h，经SDS-PAGE检测蛋白表达。按照Novagen公司的Ni NTA His-bind resin亲和柱洗脱目的蛋白，生理盐水透析，冷冻干燥。将纯化后的抗原按照常规方法免疫4只4个月大、2.1 kg健康新西兰雄性大白兔，免疫4次后取抗原，亲和纯化分离血清，-20℃保存。

1.2.5 多克隆抗体效价测定与Western-blot分析 取0.1 g 样本新鲜嫩叶加入10×体积的缓冲液（PBST + 2% PVP）充分研磨，离心后的上清为抗原，以制备的CMV多克隆抗体为一抗，碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG为二抗，进行间接ELISA，用酶标仪在波长为405 nm 处读取吸光度值，P/N≥2视为阳性样品。

为进一步验证所制备的CMV抗体的有效效价，以本文制备的CMV CP基因的多克隆抗体为第一抗体，碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体，以NBT和BCIP为显色底物，取0.1 g已用间接ELISA方法检测含有CMV病毒的植株叶片，用液氮充分研磨，加10×总蛋白提取液（0.5 mol/L Tris-HCl pH8.0+4% β-巯基乙醇+ 40%蔗糖+0.2% SDS）充分混匀，冰浴30 min，4℃ 10 000 r/min离心20 min，取上清，用于蛋白质印迹检测。

2 结果

2.1 CMV基因组结构分析

以从辣椒上提取的dsRNA为模板，利用RTPCR和TA克隆技术获得辣椒LJ-10的CMV全基因组序列。其中RNA1 长3 357 nt，内含1a ORF（97-3 075，2 979 nt），推导编码993 aa的1a蛋白；RNA2长3 042 nt，内含2a ORF（76-2 649，2 574 nt）和2b ORF（2 411-2 743，333 nt），分别推导编码858 aa 的2a蛋白和111 aa的2b蛋白；RNA3 长2 212 nt，内含3a ORF（122-958，837 nt）和CP ORF（1 257-1 910，654 nt），分别推导编码279 aa 的3a蛋白和218 aa 的CP蛋白。

2.2 CMV基因组序列分析

CMV LJ-10基因组序列与GenBank上登陆的CMV亚组IA、亚组IB、亚组II不同分离物构建系统进化树。RNA1、1a、RNA2、2a、2b、RNA3、3a、CP系统进化树和序列相似性分析结果（图1）显示，LJ-10属于CMV亚组IB。

进一步将CMV LJ-10与CMV亚组IB 6个分离物进行序列比较发现，LJ-10 RNA1、1a、RNA2、2a、2b、RNA3、3a与SD（中国，烟草）分离物序列相似性较高（表2），亲缘关系较近在系统进化树上处于一个分支（图1-A、B、C、D）。

LJ-10、IA（日本，未知）、IX（美国，番茄）3个分离物的 CP核苷酸序列相似性较低，为92.2%-93.3%；与其他SD、Phy（中国大陆，不详）、Nt9（中国台湾，不详）、Tfn（意大利，番茄）4个分离物的相似性也较低，为92.7%-93.9%；SD、Phy、Nt9、Tfn 4个分离物间相似性较高，为94.7%-99.7%（表2）。以CP核苷酸序列构建的系统进化树上LJ-10与SD分离物的亲缘关系较远，与IX、IA亲缘关系较近处于一个分支（图1-E）。

图1 CMV 1a（A）、2a（B）、2b（C）、3a（D）和CP（E）核苷酸序列系统进化树

CMV LJ-10的 1a、2a、2b、3a、CP氨基酸序列比对与系统进化树分析结果与核苷酸序列分析结果基本一致。

表2 CMV-LJ-10与亚组IB分离物的基因组RNA及推导的氨基酸序列比对

2.3 CMV CP原核表达蛋白的多克隆抗体制备

构建重组质粒pET-CMV CP 37℃ 1 mmol/L IPTG诱导2-6 h获得分子量约为27 kD与预期目的大小一致的重组表达蛋白（图2）。CMV CP蛋白长218 aa，推导编码大小约24 kD蛋白质，本文使用Noc I/Bam HI双酶切将CMV CP基因构建至原核表达载体pET-22b，获得重组质粒pET-CMV CP。即CMV CP蛋白融合pET22b载体 C端含6个His标签的21 aa，所以实际表达蛋白大小约为27 kD。

将CMV CP原核表达重组蛋白纯化后免疫兔子制备多克隆抗体。以未免疫的兔血清为对照，采用常规间接ELASA法测定，制备的抗血清可与0.2 μg/孔纯化抗原有很强的特异反应。

2.4 CMV多克隆抗体的效价分析

2015年7-8月，从石河子蔬菜花卉研究所和石河子大学北区试验田采集辣椒和加工番茄样本，以本实验制备的CMV抗体为一抗，间接ELISA可有效检出CMV，辣椒和加工番茄上CMV的检出率分别为54.1%（13/24）和60%（6/10）。

为了进一步验证ELISA实验结果的准确性，将ELISA检测为阳性的辣椒和加工番茄样品提取的总蛋白为抗原，进行Western-blot检测，结果同样显示与预期大小一致的大小约24 kD蛋白质（图3和图4）。间接ELISA和Western blot分析结果显示，本文制备的CMV抗血清1:500-1 000稀释均可有效地检测新疆辣椒和加工番茄上CMV。

图2 CMV CP表达产物的SDS-PAGE分析

3 讨论

CMV是迄今已知病毒中寄主范围最广泛的病毒，具有高度变异性和强适应性，在寄主上产生花叶，矮化，厥叶，褪绿，过敏性坏死等症状，这些症状大多以混合性出现，在新疆CMV也常与其它病毒混合侵染［19］，产生多种不同的症状［20］。通常CMV亚组I引起较严重的坏死、失绿、矮化或蕨叶等症状，而CMV亚组II只引起较温和的斑驳和花叶症状，并在接种叶上产生蚀纹斑［1，21-22］。已报道CMV亚组IA和CMV亚组II在全世界范围内都有分布，而CMV亚组IB主要在亚洲地区，且CMV亚组IB的变异率高于CMV亚组IA和CMV亚组Ⅱ变异率［11］。

图3 感染CMV的辣椒叶组织的Western blot特异性检测

图4 感染CMV的加工番茄叶组织的Western blot特异性检测

新疆番茄、辣椒、南瓜、甜菜等等不同寄主植物上的CMV均归为CMV IB亚组，使用从美国NEOGEN生物技术有限公司购买的CMV I型抗体可以有效检测番茄、南瓜等寄主上CMV，然而从新疆石河子蔬菜研究所蔬菜种子繁育基地上采集的辣椒样品上其检出率极低，在加工番茄上也存在漏检的现象［15］。酶联免疫吸附法（Enzyme linked immol/Lunosorbent assay，ELISA）是目前应用非常广泛的适用于大田大量样品病毒病的快速检测的免疫学方法，利用病毒外壳蛋白制备基因工程抗体，已广泛应用于CMV抗血清的制备［16］。

CMV是新疆加工番茄、辣椒等经济类蔬菜上危害最严重的病毒［23-25］，因此本文从美国NEOGEN公司CMV I型抗体血清学检测为阴性的新疆石河子蔬菜研究所采集辣椒LJ-10克隆、分析了CMV全基因组序列，并以其CP基因制备了多克隆抗体，为新疆CMV检测、预防及研究病毒与寄主互作奠定了基础。

4 结论

序列分析及系统进化树结果表明，新疆辣椒LJ-10 CMV分离物属于CMV亚组IB；成功构建了LJ-10 CMV CP基因的原核表达载体，制备了相应的多克隆抗体，抗血清效价为1∶500-1 000，能够有效的用于新疆辣椒和加工番茄的检测。

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(责任编辑 朱琳峰）

Genome Sequencing of CMV Isolated from Pepper in Xinjiang and Polyclonal Antibody Preparation of CP Gene

ZHOU Dong LIU Zhen LIU Li XU Peng-cheng ZHENG Yin-ying
（College of Life Sciences，Key Laboratory of Agriculture Biotechnology of Shihezi University，Shihezi University，Shihezi 832003）

This work aims to clone gene fragment of Cucumber mosaic virus（CMV）from pepper LJ-10 in Xinjiang，to analyze the sequence，construct the prokaryotic expression vector of CMV CP gene，and to prepare CP’s polyclonal antibodies. The complete genome fragments of RNA1（3 357 nt），RNA2（3 042 nt），and RNA3（2 212 nt）were cloned by RT-PCR，and compared with different CMV isolates from CMV subgroup IA，subgroup IB and subgroup II in the GenBank by sequence analysis and phylogenetic tree analysis. The CP gene of CMV in LJ-10 was cloned into prokaryotic expression vector pET-22b and expressed in Escherichia coli BL21（DE3），and the expressed proteins were purified. Rabbit was immunized with the purified protein to prepare the antiserum with CMV-specificity，and detected by indirect ELISA test and Western blot. As results，the genomes of RNA1，RNA2，and RNA3 were successfully cloned，the sequence analysis and phylogenetic tree analysis showed that the isolates belonged to CMV subgroup IB. The prokaryotic expression vector pET-CMV-CP was successfully constructed and expressed as a 27 kD recombinant protein in E. coli BL21（DE3）by IPTG induction，and whose molecular weight was identical to the expected one. The indirect ELISA test and Western blotting showed that the antiserum’s titer was 1：500-1 000. In conclusion，the CMV isolate from LJ-10 belongs to CMV subgroup IB. The prokaryotic expression vector of CMV CP gene from LJ-10 is successfully constructed，and the corresponding polyclonal antibody is prepared.

Cucumber mosaic virus；sequence analysis；coat protein gene；prokaryotic expression；Western blot

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0206

2017-01-06

国家自然科学基金项目（31460466）

周东，男，硕士研究生，研究方向：植物分子遗传学；E-mail：983692757@qq.com

郑银英，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：植物病毒学与植物分子遗传学；E-mail：69825983@qq.com