赵巧玲 刁秀楠 郭春绒 赵晋忠 杜维俊 岳爱琴

（山西农业大学，太谷 030801）

山西大豆皂苷类型及其关键酶基因表达分析

赵巧玲 刁秀楠 郭春绒 赵晋忠 杜维俊 岳爱琴

（山西农业大学，太谷 030801）

大豆皂苷Aa、Ab的含量影响大豆制品口感，旨在了解大豆籽粒中皂苷Aa和Ab的组成及含量，进而研究其合成代谢机制。采用HPLC-ESI-MS/MS技术测定大豆材料中Aa、Ab皂苷的含量，利用qRT-PCR技术研究籽粒发育过程中GmSg-1基因的相对表达量。结果显示，68个山西大豆材料种子中Aa型大豆材料胚和子叶中Aa皂苷含量的变异范围分别为0.41-33.79 mg/g，0.21-8.39 mg/g；Ab型大豆胚和子叶中Ab皂苷的变异范围分别为0.85-44.96 mg/g，0.26-11.09 mg/g。GmSg-1基因序列有19个SNP多态性位点，其中10个SNP引起氨基酸变异。Aa、Ab大豆皂苷含量在籽粒发育过程中呈现先增后减的趋势，在开花后40-50 d皂苷含量达到最大值，而GmSg-1基因的相对表达量在前期呈现与含量基本相同的趋势。

大豆；皂苷；GmSg-1

大豆皂苷（Soyasaponin）是大豆生长过程中的一类次生代谢产物［1］。具有许多对人体有益的生理功能［2-5］，因此越来越受到人们的重视。大豆皂苷种类繁多、结构复杂，根据大豆皂苷苷元的不同目前把发现的54种大豆皂苷［6-8］分为7类：A类、B类、DDMP类、E类、H类、I类和J类皂苷［9-12］。

A类大豆皂苷是以大豆皂醇A为苷元，在其C-3和C-22位各结合一个糖基链，根据糖基链的不同A类皂苷又可分为Aa、Ab和Ao 3个系列［6，9，12，13］。Aa和Ab系列C-22位上分别连有乙酰化木糖基和乙酰化葡萄糖基［14］，Ao系列皂苷是不含乙酰化糖基的［15］。GmSg-1基因编码Aa和Ab皂苷合成的关键酶UGT73F4和UGT73F2（图1）。A类皂苷C-22位末端糖基乙酰化会导致大豆及其制品味道苦涩［16］，这严重影响其口感。因此，为了改善大豆制品的口感，降低和去除A类皂苷，逐渐成为目前研究的热点。

本研究采用高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱联用技术（High performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandern mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）测定68份大豆材料胚和子叶中Aa、Ab皂苷的含量以及籽粒发育过程中Aa、Ab皂苷的含量，利用qRT-PCR技术研究了籽粒发育过程中Aa、Ab皂苷合成的关键酶基因GmSg-1的表达量，并分析GmSg-1基因DNA序列的多态性。旨在了解大豆籽粒中大豆皂苷Aa和Ab的合成代谢机制，为降低大豆籽粒中A类皂苷含量以及改良大豆品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取适宜山西种植的68份大豆材料作为实验材料，所有材料由山西农业大学大豆育种室提供。供试大豆材料于2015年种植于山西农业大学实验农场，按小区种植，3次重复。大豆种子成熟后自然晾干，分离胚和子叶，保存用于检测大豆皂苷。

开花期对晋豆52、晋遗30、千斤豆、武黑、中黄13、L-6开花时间相同且在同一部位的花进行挂牌标记，分别取开花后25、32、40、50、60和70 d的大豆荚，每荚取两粒大豆籽粒，其中一粒用于大豆皂苷的测定，低温冷冻干燥，-20℃保存备用。另一粒用于基因表达分析，并立即将籽粒于液氮中冷冻，于-80℃保存备用。每个时期取材均3次重复。

1.2 方法

1.2.1 Aa、Ab皂苷含量的测定 参考岳爱琴等［17］测定大豆皂苷的方法，采用HPLC-ESI-MS/MS测定不同大豆材料胚和子叶中Aa、Ab皂苷的含量。

图1 Aa和Ab皂苷合成途径

1.2.2 GmSg-1基因的获得和测序 采用CTAB法提取材料基因组DNA，使用BioPhotometer D30核酸蛋白测定仪测定DNA的浓度和质量，将DNA稀释至20 ng/μL供后续实验使用。用Primer Premier 5软件，参照NCBI公布的GmSg-1序列（AB628091），设计引物F1/R1（F1：5′-ATGGGGTCTCTTGTCATCTTCA -3′；R1：5′-TTTAGAGAACAAAAGAAGGCGTAGT-3′）。以材料基因组DNA为模板，用PCR扩增目标片段。PCR体系总体积15 μL，其中DNA模板（20 ng/μL）2.1 μL、5×buffer 3.0 μL、正反引物各0.3 μL（10 μmol/L）、dNTP（2.5 μmol/L）0.4 μL、TransStart®Fast Pfu 0.3 μL和ddH2O 8.6 μL。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 1 min，57℃ 45 s，72℃ 1 min 48 s，35个循环；72℃ 10 min，15℃保存。用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR产物，对单一目标条带进行割胶回收，送上海生工进行测序。

表1 不同品种大豆的分类

1.2.3 目标基因DNA序列单核苷酸多态性分析 利用DNAStar软件分析GmSg-1序列的基因多态性位点。

1.2.4 qRT-PCR检 测GmSg-1基 因表 达 利 用Trizol法［18］提取RNA，TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金）试剂盒转录cDNA。利用Primer Premier 5.0软件设计目标片段长度为100 bp左右的qRT-PCR引物F2/R2（F2：5′-TCCTGGGCGGATGACG-3′；R2：5′-CGGAATGGAGTTCGGGG-3′），选择CYP2基因作为内参基因（引物F3：5′-CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA-3′；R3：5′-CCCCTCCACTACAAAGGCTCG-3′）。反应总体积为10 μL，含SYBR Premix Ex Taq II 5 μL，引物各1 μL（10 μmol /L），cDNA模板1 μL（100 ng/μL）和RNase Free water 3 μL。qRT-PCR程序为：95℃ 30 s；95℃ 5 s；58℃ 15 s，40次循环，每个循环采集一次信号；完成以上步骤后，65℃ 5 s；完成最后的荧光信号采集，3次重复。

2 结果

2.1 大豆皂苷组成多态性分析

对山西68份大豆材料种子中的大豆皂苷组成进行多态性分析，分为Aa型、Ab型、AaAb型3种类型（图2），所占比例分别为51.5%、44.1%和4.4%，说明本试验山西大豆材料大豆皂苷类型主要为Aa型和Ab型。其中35份大豆材料为Aa型，30份大豆材料为Ab型，3份大豆材料（晋大47、SNWS285、中黄42）为AaAb型（表1）。

2.2 不同类型大豆材料Aa、Ab皂苷含量分析

采用HPLC-ESI-MS/MS法分别测定了不同大豆材料胚和子叶中Aa、Ab皂苷的含量，结果（表2）表明，不同大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量相差较大，Aa型大豆材料胚和子叶中Aa皂苷含量的变异范围分别为0.41-33.79 mg/g和0.21-8.39 mg/g，Ab型大豆材料胚和子叶中Ab皂苷含量的变异范围分别为0.85-44.96 mg/g和0.26-11.09 mg/g。胚中Aa或Ab皂苷含量均高于子叶。

表2 大豆胚和子叶中Aa、Ab皂苷含量分析（mg·g-1）

图2 三种类型大豆的HPLC-ESI-MS/MS谱图

2.3 籽粒不同发育时期大豆皂苷含量的分析

采用HPLC-ESI-MS/MS法分别对3种Aa型（武黑、中黄13、L-6）、3种Ab型（晋豆52、晋遗30、千斤豆）大豆材料籽粒不同发育时期Aa和Ab皂苷含量进行测定。结果（图3）表明，Aa型和Ab型大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量均在开花后40-50 d达到最大值，之后随着大豆的成熟，大豆皂苷含量降低，总体呈先增后减的变化趋势。

2.4 GmSg-1基因的多态性分析

从NCBI得知，GmSg-1基因位于染色体7 -NC_016094.2，开放性阅读框为1383 bp，测序结果与cDNA进行比对结果表明该序列没有内含子。用GmSg-1基因特异性引物F1/R2对5种Aa型、5种Ab型大豆材料的GmSg-1基因进行扩增，电泳结果显示10个材料均在1 800 bp左右有单一条带（图4）。对测序所得DNA序列进行比对，结果（表3和图5）表明GmSg-1a和GmSg-1b基因共有19个SNP位点差异，其中10个SNP位点引起氨基酸变异，其余9个SNP为同义突变。

2.5 不同发育时期GmSg-1基因相对表达量分析

对晋遗30不同发育时期籽粒中GmSg-1基因的表达进行分析，结果（图6）表明，GmSg-1和CYP2基因的溶解曲线峰值单一，引物的特异性好，所得实验数据可靠。GmSg-1基因相对表达量在开花后25、32、40、50、60 d呈现先增后减的趋势，开花后70 d时相对表达量变高（图7）。开花后40 d GmSg-1基因相对表达量显著高于25 d和32 d，开花后50 d、60 d表达量显著降低。GmSg-1基因相对表达量变化趋势与籽粒皂苷含量变化趋势基本一致（图3），最后一个时期GmSg-1基因相对表达量与皂苷含量变化趋势不一致，可能是其他基因调控所致，还有待进一步研究。

图3 不同发育时期籽粒大豆皂苷含量分析

3 讨论

大豆皂苷是大豆发育过程中的一种重要次生代谢产物［1］，具有许多对人体有益的生理功能［2-5］。目前发现大豆皂苷由54种皂苷组成［8］，其中A类皂苷中Aa、Ab皂苷C-22位末端糖基乙酰化是导致大豆及其制品味道苦涩的主要原因［6，14］。A 类皂苷缺失的大豆材料其大豆制品口感较好［13］。前人研究表明大豆皂苷在不同大豆种质材料中具有丰富的遗传变异［19］。因此，对大豆种质资源的皂苷组成和含量进行研究，不断筛选出皂苷组成和含量特异材料，不仅可以用于大豆皂苷的代谢机制研究，还可以用于大豆皂苷品质的遗传改良。本研究利用HPLCESI-MS/MS对具有代表性的68份山西大豆材料种子中大豆皂苷组成进行多态性分析，发现供试材料分为Aa、Ab、AaAb 3种类型，并且主要为Aa和Ab型。Takahashi等［20］对我国3 731份野生大豆资源大豆皂苷类型进行鉴定，结果也表明Aa 型和Ab 型为主要类型，同时他们发现了一份Aa和Ab皂苷均缺失的Ao类型野生大豆材料。本研究供试材料中未发现Ao类型，但研究发现Aa和Ab皂苷含量存在较大的变异范围，Aa和Ab皂苷含量低的大豆材料可用于今后改良大豆皂苷品质的改良。

图4 GmSg-1基因PCR结果检测

表3 GmSg-1基因的多态性位点

图5 Aa型、Ab型大豆GmSg-1基因序列比对

图6 目标基因的溶解曲线

图7 晋遗30不同发育时期表达量分析

通过研究不同品种大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量以及大豆籽粒成熟过程中皂苷Aa、Ab的积累和GmSg-1基因的表达量发现，参试大豆材料籽粒胚和子叶中Aa、Ab皂苷变异范围大，说明我国拥有的大豆资源Aa、Ab皂苷变异丰富，对今后研究大豆皂苷品质育种工作具有重要意义。

本研究对晋遗30大豆籽粒不同发育时期的GmSg-1基因相对表达量进行研究，结果表明GmSg-1基因表达量呈现先增后减的趋势，与其Ab含量的变化趋势基本一致。但GmSg-1基因在大豆开花后70 d 籽粒中表达量达到最大，这可能说明是GmSg-1基因是大豆皂苷Aa、Ab合成的关键酶基因，但是大豆皂苷Aa、Ab合成过程中是否还有其他基因调控，仍有待于进一步研究。

4 结论

本研究发现，68个品种大豆中Aa型大豆胚和子叶中Aa皂苷的变异范围分别是0.41-33.79 mg/g，0.21-8.39 mg/g；Ab型大豆胚和子叶中Ab皂苷的变异范围分别是0.85-44.96 mg/g，0.26-11.09 mg/g。大豆不同发育时期籽粒Aa、Ab皂苷含量呈现先增后减的趋势，在开花后40-50 d皂苷含量达到最大值。测序发现Aa、Ab型大豆材料GmSg-1基因共有19个SNP多态性位点，其中10个SNP引起氨基酸变异。对不同发育时期表达量进行分析，发现变化趋势呈先增后减，与皂苷含量变化趋势基本一致。

［1］Vincken JP, Heng L, De GA, et al. Saponins, classification and occurrence in the plant kingdom［J］. Phytochemistry, 2007, 68（3）：275-297.

［2］Ellington AA, Berhow M, Singletary KW. Induction of macroautophagy in human colon cancer cells by soybean B-group triterpenoid saponins［J］. Carcinogenesis, 2005, 26：159-167.

［3］Ishii Y, Tanizawa H. Effects of soyasaponins on lipid peroxidation through the secretion of thyroid hormones［J］. Biol Pharm Bull, 2006, 29：1759-1763.

［4］Osbourn A. Saponins and plant defence-A soap story［J］. Trends Plant Sci, 1996, 1：4-9.

［5］李万林, 钟姣姣, 刘军海. 豆粕中大豆皂苷提取, 精制研究进展［J］. 饲料与畜牧：新饲料, 2014（4）：15-18.

［6］Krishnamurthy P, Tsukamoto C, Singh RJ, et al. The Sg-6 saponins, new components in wild soybean（Glycine soja Sieb. and Zucc. ）：polymorphism, geographical distribution and inheritance［J］. Euphytica, 2014, 198（3）：413-424.

［7］Krishnamurthy P, Lee JM, Tsukamoto C, et al. Evaluation of genetic structure of Korean wild soybean（Glycine soja）based on saponin allele polymorphism［J］. Genetic Resources and Crop Evolution, 2014, 61（6）：1121-1130.

［8］Kang J, Badger TM, Ronis MJJ, et al. Non-isoflavone phytochemicals in soy and their health effects［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58（14）：8119-8133.

［9］Zhang W, Popovich DG. Chemical and biological characterization of oleanane triterpenoids from soy［J］. Molecules, 2009, 14（8）：2959-2975.

［10］Panneerselvam K, Chigen T, Yuya T, et al. Comparison of saponin composition and content in wild soybean（Glycine soja Sieb. and Zucc. ）before and after germination［J］. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2014, 78（12）：1988-1996.

［11］Kudou S, Tonomura M, Tsukamoto C, et al. Isolation and structural elucidation of the major genuine soybean saponin［J］. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1992, 56（1）：142-143.

［12］Takada Y, Sasama H, Sayama T, et al. Genetic and chemical analysis of a key biosynthetic step for soyasapogenol A, an aglycone of group A saponins that influence soymilk flavor［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2013, 126（3）：721-731.

［13］Park J, Kim JH, Krishnamurthy P, et al. Characterization of a new allele of the saponin-synthesizing gene, in soybean［J］. Crop Science, 2016, 56（1）：1-7.

［14］Okubo K, Iijima M, Kobayashi Y, et al. Components responsible for the undesirable taste of soybean seeds［J］. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 1992, 56（1）：99-103.

［15］Takada Y, Sayama T, Kikuchi A, et al. Genetic analysis of variation in sugar chain composition at the C-22 position of group A saponins in soybean, Glycine max（L.）Merrill. ［J］. Breeding Science, 2010, 60（1）：3-8.

［16］Krishnamurthy P, Tsukamoto C, Yang SH, et al. An improved method to resolve plant saponins and sugars by TLC［J］. Chromatographia, 2012, 75（23-24）：1445-1449.

［17］岳爱琴, 王卫东, 徐海军, 等. 不同大豆品种大豆皂苷组成分析［J］. 中国粮油学报, 2017, 32（5）：38-42.

［18］刘易科, 孙洪波, 简波, 等. 2种大豆总RNA提取方法的改良［J］. 西北农林科技大学学报：自然科学版, 2006, 34（12）：83-86.

［19］Tsukamoto C, Kikuchi A, Harada K, et al. Genetic and chemical polymorphisms of saponins in soybean seed［J］. Phytochemistry, 1993, 34（5）：1351-1356.

［20］Takahashi Y, Li X, Tsukamoto C, et al. Identification of a novel variant lacking group A soyasaponin in a Chinese wild soybean（Glycine soja Sieb. & Zucc. ）：implications for breeding significance［J］. Plant Breeding, 2016, 135（5）：607-613.

（责任编辑 朱琳峰）

Type Analysis of Saponin and Gene Expression of Key Enzyme in Shanxi Soybeans

ZHAO Qiao-ling DIAO Xiu-nan GUO Chun-rong ZHAO Jin-zhong DU Wei-jun YUE Ai-qin
（Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

The contents of soysaponin Aa and Ab determine the taste of soybean products，this study aims to understand the composition and content of Aa and Ab soysaponin in soybean seeds，and then to study the mechanism of anabolism and synthesis. HPLC-ESI-MS/MS was employed to measure the contents of Aa and Ab saponins in soybean，and qRT-PCR technique to study the relative expression of GmSg-1 gene in grain accumulation. Results showed among 68 Shanxi soybean seeds，the range of Aa saponin variation were 0.41-33.79 mg/g and 0.21-8.39 mg/g in hypocotyls and cotyledons respectively for Aa type soybean materials；and the range of Ab saponin variation were 0.85-44.96 mg/ g and 0.26-11.09 mg/g for Ab type soybean materials. There were 19 SNP variants in GmSg-1 gene，and 10 of them resulting in amino acid substitutions were detected. The contents of Aa and Ab soysaponin increased at first and then decreased in the process of accumulation，and the contents of soysaponin were the highest after blossoming 40-50 d，while the relative expression of GmSg-1 gene was basically in the same trend as the content of soysaponin.

soybean；saponin；GmSg-1

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0395

2017-05-15

国家自然科学基金项目（31171580），山西省自然科学基金项目（201601D011076），山西省高等学校科技创新项目（2015148），山西农业大学中青年拔尖创新人才支持计划（201203），山西农业大学引进人才科研启动费（dwj）

赵巧玲，女，硕士研究生，研究方向：大豆品质研究；E-mail：1009495213@qq.com

岳爱琴，女，副教授，研究方向：大豆品质育种；E-mail：yueaiqinnd@126.com