李一鸣， 陈孝甜， 王勇庆， 程东美， 张志祥

(1 天然农药与化学生物学教育部重点实验室/华南农业大学 农学院，广东 广州 510642； 2 忡恺农业工程学院 农学院，广东 广州 510225)

印楝素干粉的制备及生物活性测定

李一鸣1， 陈孝甜1， 王勇庆1， 程东美2， 张志祥1

(1 天然农药与化学生物学教育部重点实验室/华南农业大学 农学院，广东 广州 510642； 2 忡恺农业工程学院 农学院，广东 广州 510225)

【目的】测定印楝素干粉及印楝素A、印楝素B的生物活性，建立印楝素干粉中印楝素含量的检测方法。【方法】采用乙酸乙酯浸提法制备印楝素干粉，HPLC法检测印楝素含量，叶碟法测定生物活性。【结果】处理 24 h后，印楝素干粉对斜纹夜蛾Spodopteralitura2 龄幼虫和大菜粉蝶Pierisbrassicae3龄幼虫的AFC50值分别为0.28和70.71 μg·mL-1，拒食活性明显高于印楝素A和印楝素B。【结论】该干粉制备方法不仅简单有效，且生物活性良好，具有推广应用价值。

印楝素干粉； 斜纹夜蛾； 大菜粉蝶； 乙酸乙酯浸提法； 叶碟法； HPLC； 生物活性

印楝Azadirachtaindica为楝科楝属乔木[1]，原产国主要是印度和缅甸，大多分布在热带以及亚热带地区[2]。1983年，印楝首次被引入我国，该项目由华南农业大学赵善欢教授发起，后在海南省、四川省和云南省大面积引种并获得成功[3]。印楝素是从印楝中提取出来的一种四环三萜类固醇化合物[4-5]，对昆虫具有胃毒、触杀、拒食、驱避、抑制呼吸[6-7]、调节生长和节育等作用[8]。雄性和雌性大鼠试验表明印楝素对脊椎动物是安全的，以每天500、1 000和1 500 mg·kg-1的剂量口服施用持续90 d，没有产生生理毒性、死亡，组织质量、病理学、血清和血液参数没有变化[9]。研究表明印楝素对大部分农业害虫的天敌也不会产生较大的影响[10]。此外，印楝素在环境中能迅速而彻底地降解、抗性风险低[11]，被认为是完美的植物源杀虫剂[12-13]。印楝中已发现了100多种化合物，至少有 70 种化合物具有生物活性。印楝素可分为印楝素A、B、C、D、E、F、G、I共8种，其中印楝素A含量最高，其也是通常意义上的印楝素[14]。印楝植株中印楝素A和印楝素B的含量在所有印楝素类化合物中占比最高。这些活性物质对菜青虫Pierisrapae、小菜蛾Plutellaxylostella等多种农业害虫都有很好的杀虫活性[15-17]。

斜纹夜蛾Spodopteralitura属鳞翅目夜蛾科，全国各地均有分布[18]，寄主广泛，可危害蔬菜、粮食、经济作物等近100科、300多种植物，造成严重的经济损失[19]。大菜粉蝶Pierisbrassicae属鳞翅目粉蝶科，是十字花科蔬菜上的主要害虫之一，以幼虫聚集为害叶片[20]。目前，防治斜纹夜蛾、大菜粉蝶多用化学药剂，植物源农药防治较为少见。本研究采用乙酸乙酯浸取法提取印楝素种子中的印楝素制备印楝素干粉，并将其与印楝素A及印楝素B的活性进行比较，以期为防治斜纹夜蛾、大菜粉蝶提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

印楝种子由四川绿金生物科技有限公司提供，印楝素质量分数为0.37%；印楝素A标准品(质量分数96.8%)：美国Sigma公司生产；印楝素B(质量分数95.2%)由华南农业大学昆虫毒理研究室从印楝种子中分离纯化并进行结构鉴定。

从广东省广州市郊的芋头Cococasiaesculenta、芥蓝Brassicaalboglabra或花椰菜Brassicaoleraceavar.botrytis上采集斜纹夜蛾卵块，低龄虫以芋头叶饲养，高龄虫以木薯叶饲养。于云南省昆明市郊采集大菜粉蝶卵，卵孵化后，幼虫在华南农业大学昆虫毒理研究室内用芥蓝和甘蓝Brassicaoleracea叶饲养。

美国惠普1100高效液相色谱仪，具可调波长的紫外检测器，3D化学工作站；HHS·11-Ni型恒温水浴锅：北京靖卫科学仪器厂生产；4001型旋转蒸发仪：德国Heidolph公司生产；LI-3000叶面积测定仪：美国Lincoin公司制造；1702-MP8型电子天平：德国Startorius Gmbh Gottingen公司生产；循环水真空泵SHB-Ⅲ；布氏漏斗等。

乙酸乙酯、石油醚Ⅰ(30～60 ℃)、石油醚Ⅱ(60～90 ℃)均为分析纯(天津富宇精细化工有限公司)，乙腈为色谱纯(美国MREDA)，超纯水，电阻≥18.2 ΜΩ等。

1.2 方法

1.2.1 印楝素干粉提取 在烘箱中于40 ℃条件下烘烤印楝种子3 h后，将其在室温条件下磨碎，加入石油醚Ⅰ进行脱脂处理，用大滤纸滤除部分石油醚，再用布氏漏斗滤除滤渣中残余的石油醚。将晾干的滤渣常温减压干燥后粉碎，制得印楝种子粉。在60 ℃水浴条件下，用乙酯乙酯浸提印楝种子粉，重复3次，每次5 h，滤除残渣，合并滤出液，用旋转蒸发仪于60 ℃条件下减压蒸除乙酸乙酯得到乙酸乙酯抽提物。在抽提物中加入少量乙酸乙酯，振荡摇匀后，于室温条件下滴加到石油醚中，边加边振荡，将沉淀过滤，用石油醚洗涤3次，减压干燥制得印楝素干粉。

1.2.2 印楝素含量测定 称取印楝素标准品于容量瓶中，甲醇溶解并定容。再次使用甲醇稀释配成系列浓度标准溶液，以标准溶液浓度对峰面积绘制得标准曲线。

色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流动相为不同比例的乙腈和水进行梯度洗脱，流速为1 mL·min-1，流动相比例及处理时间为：V(乙腈)∶V(水)=40∶60，0～3 min，V(乙腈)∶V(水)=30∶70，3～9 min，V(乙腈)∶V(水)=100∶0，9～13 min，V(乙腈)∶V(水)=40∶60，13～20 min。柱温：30 ℃；检测波长：215 nm；进样量：10 μL。准确称取1.0 g制备好的印楝素干粉于15 mL离心管中，加入10 mL甲醇,涡旋2 min，离心，过0.22 μm滤膜，待HPLC测定，外标法计算含量。

1.2.3 拒食活性测定 选取厚薄均匀的甘蓝叶片，用打孔器打出叶碟(d=19 mm)，叶碟在供试药液中浸3 s后取出,自然晾干后，将叶碟置于垫有保湿滤纸的培养皿中，每皿3片叶，接入1头虫,每个处理10个重复。24 h后调查并按公式计算拒食率。

1.2.4 体质量测定 将印楝素干粉、印楝素A和印楝素B，用V(丙酮)∶V(水)=1∶1的溶液配至供试浓度。将刚采集的甘蓝叶片洗净晾干。将供试叶片在药液中浸泡3 s后取出，晾干后放入垫有保湿滤纸的培养皿中，在每个培养皿中放入1头幼虫，每个处理10个重复，处理质量浓度为0.5 μg·mL-1。幼虫放入培养皿前在电子天平上称质量。每隔1 d换上新的滤纸及新鲜的未处理供试叶片，每天在电子天平上称供试昆虫的体质量。

2 结果与分析

2.1 印楝素HPLC检测结果

乙酸乙酯浸提印楝种子粉，乙酸乙酯减压蒸除后，用石油醚从浓缩液中制备印楝素干粉。图1a中印楝素A标准品的保留时间为9.463 min。印楝素干粉色谱图如图1b所示。

图1 印楝素HPLC图谱Fig.1 HPLC graph of azadirachtin

2.2 印楝素干粉中印楝素含量测定

乙酸乙酯浸提法制备得到印楝素干粉，干粉中印楝素质量分数(以印楝素A计)和提取率分别为7.920%和81.047%。滤出沉淀后，在室内敞开体系中让溶剂自然挥发，沉淀不黏结；减压干燥后，呈外观良好的浅黄色粉状物。试验结果表明该方法能有效提取印楝素。

2.3 拒食活性测定结果

分别以斜纹夜蛾2龄幼虫、大菜粉蝶3龄幼虫为对象，测定印楝素A、印楝素B和印楝素干粉的非选择性拒食活性，结果见表1。从表1中可以看出，印楝素干粉、印楝素A和印楝素B均对斜纹夜蛾2龄幼虫具有较好的拒食活性，处理24 h后，AFC50分别为0.28、1.04和2.93 μg·mL-1；AFC5095%置信限分别为0.24～0.33、0.71～1.51和2.07～4.16 μg·mL-1。处理24 h后，印楝素干粉、印楝素A和印楝素B对大菜粉蝶3龄幼虫的AFC50分别为70.71、182.34和225.44 μg·mL-1；AFC5095%置信限分别为57.61～86.78、118.54～280.47和135.09～376.20 μg·mL-1。结果表明，印楝素干粉对斜纹夜蛾和大菜粉蝶的拒食活性明显高于印楝素A和印楝素B。印楝素干粉、印楝素A和印楝素B对大菜粉蝶3龄幼虫具有一定的拒食活性。

2.4 印楝素对斜纹夜蛾幼虫体质量的影响

以斜纹夜蛾4龄幼虫为对象，采用浸药叶片处理，测定印楝素干粉、印楝素A和印楝素B对斜纹夜蛾4龄幼虫体质量的影响，结果见表2。从表2中可以看出，印楝素干粉、印楝素A和印楝素B对斜纹夜蛾幼虫的体质量具有非常显著的抑制作用。在试验浓度下处理2～5 d，印楝素干粉和印楝素B对斜纹夜蛾幼虫的体质量影响明显高于印楝素A，差异显著。在相同浓度下处理1～5 d，印楝素干粉对斜纹夜蛾幼虫生长发育的影响明显高于印楝素B，且在药后1、3、4 d时差异显著。

表1 印楝素A、印楝素B及印楝素干粉对斜纹夜蛾和大菜粉蝶拒食活性测定结果1)

Tab.1 The antifeedant activities of azadirachtin A, azadirachtin B and azadirachtin-rich dry powder againstSpodopteralituraandPierisbrassicae

处理斜纹夜蛾2龄幼虫大菜粉蝶3龄幼虫毒力回归方程2)AFC50(95%置信限)/(μg·mL-1)相关系数(r)毒力回归方程2)AFC50(95%置信限)/(μg·mL-1)相关系数(r)印楝素Ay=4.9601+2.5597x1.04(0.71～1.51)0.9899y=0.0408+2.1935x182.34(118.54～280.47)0.9769印楝素By=3.8222+2.5197x2.93(2.07～4.16)0.9763y=1.0708+1.6699x225.44(135.09～376.20)0.9458印楝素干粉y=5.8974+1.6301x0.28(0.24～0.33)0.9885y=2.3874+1.4126x70.71(57.61～86.78)0.9984

1)印楝素干粉中有效成分的含量以印楝素A计，干粉中印楝素A质量分数为7.920%， 处理时间为24 h； 2)y为死亡率，x为样品质量浓度对数值。

表2 施用印楝素干粉、印楝素A和印楝素B对斜纹夜蛾幼虫体质量的影响1)

Tab.2 The effects of azadirachtin-rich dry powder, azadirachtin A and azadirachtin B on larvae weight of Spodoptera lituram/g

1)干粉中有效成分含量以印楝素A计，干粉中印楝素A质量分数为7.920%，处理时间为72 h；同列数据后凡具有一个相同字母者，表示在5%水平上差异不显著(DMRT)。

3 结论

w为0.3%的印楝素乳油是目前市面唯一基于印楝素干粉的制剂，然而乳油制剂中成分比重大的有机溶剂，如苯、甲苯、二甲苯、甲醇等，不仅对环境有害，还会对人类健康造成严重威胁[21]。需要制备含量及活性更高的印楝素干粉，使制备新的印楝素制剂，如微乳液和悬浮浓缩物等成为可能。本文使用乙酸乙酯浸提法制备了印楝素干粉。该提取方法不仅简单有效，制备得到的印楝素干粉对斜纹夜蛾及大菜粉蝶的活性更是优于印楝素A及印楝素B。印楝素干粉是植物直接提取物，其化学成分比印楝素A及印楝素B更为复杂，不仅包含其他多种的印楝同系物，还可能具有其他活性物质，因而生物活性更高。

本研究建立了印楝素干粉的HPLC检测方法，能快速高效地测定印楝素干粉中印楝素A的含量，分离效果好，对检测印楝素A及印楝素干粉具有一定的参考意义。

[1] 徐汉虹, 何道航, 魏孝义, 等. 国产印楝种子中印楝素的结构鉴定[J]. 华南农业大学学报, 2001, 22(3): 20-22.

[2] 龚伟, 胡庭兴, 宫渊波, 等. 印楝在我国的引种与经营利用现状[J]. 四川林业科技, 2004, 25(3): 48-52.

[3] 冯沙克, 赵元藩. 云南省印楝种植及相关产业的发展现状[J]. 林业调查规划, 2007, 32(5): 79-82.

[4] 段琼芬, 王有琼, 孙龙, 等. 4种提取印楝素方法的比较[J]. 农药, 2005, 44(10): 455-456.

[5] JARVIS A P, MORGAN E D. Analysis of small samples of limonoids of neem (Azadirachtaindica) using solid phase extraction from tissue culture[J]. Phytochem Anal, 2000, 11(3): 184-189.

[6] SAKURAI K, TANINO K. Synthetic studies on azadirachtin: Construction of the ABC ring systemviathe Diels-Alder reaction of a vinyl allenylsilane derivative[J]. Tetrahedron Lett, 2015, 56(3): 496-499.

[7] REMEDIO R N, NUNES P H, ANHOLETO L A, et al. Morphological effects of neem (AzadirachtaindicaA. Juss) seed oil with known azadirachtin concentrations on the oocytes of semi-engorgedRhipicephalussanguineusticks (Acari: Ixodidae)[J]. Parasitology Res, 2015, 114(2): 431-444.

[8] 操海群, 岳永德, 花日茂, 等. 植物源农药研究进展[J]. 安徽农业大学学报, 2000, 27(1): 40-44.

[9] RAIZADA R B, SRIVASTAVA M K, KAUSHAL R A, et al. Azadirachtin, a neem biopesticide: Subchronic toxicity assessment in rats[J]. Food Chem Toxicol, 2001, 39(5): 477-483.

[10]李泳. 植物源杀虫剂对储粮害虫米象生物活性的初步研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2013.

[11]MAITRA B, SEN S, HOMECHAUDHURI S. Flow cytometric analysis of fish leukocytes as a model for toxicity produced by azadirachtin-based bioagrocontaminant[J]. Toxicol Environ Chem, 2014, 96(2): 328-341.

[12]高全. 印楝素活性成分对照品的分离制备[D]. 合肥: 安徽农业大学, 2015.

[13]KANOKMEDHAKUL S, KANOKMEDHAKU K, PRAJUABSUK T, et al. Azadirachtin derivatives from seed kernels of azadirachta excelsa[J]. J Nat Prod, 2005, 68(7): 1047-1050.

[14]张国洲, 吴恭谦. 植物性杀虫剂研究进展[J]. 安徽农业大学学报, 2002, 29(1): 25-28.

[15]张志祥, 程东美, 徐汉虹, 等. 印楝素A和印楝素B的生物活性及增效作用[J]. 华中农业大学学报, 2004, 23(5): 515-518.

[16]张志祥, 程东美, 徐汉虹. 印楝素A和印楝素B生物活性比较[J]. 植物保护, 2007, 33(3): 80-82.

[17]张志祥, 田永清, 程东美, 等. 印楝素A和印楝素B的稳定性比较[J]. 南京农业大学学报, 2005, 28(1): 125-127.

[18]王瑞龙, 孙玉林, 梁笑婷, 等. 6种植物次生物质对斜纹夜蛾解毒酶活性的影响[J]. 生态学报, 2012, 32(16): 5191-5198.

[19]邓劲松. 生物农药印楝素防治蔬菜斜纹夜蛾试验[J]. 植物医生, 2015, 28(2): 32-33.

[20]张余杰, 张亚, 董丁铭, 等. 坡柳皂苷对大菜粉蝶生长发育的抑制活性[J]. 农药学学报, 2014, 16(1): 102-105.

[21]刘文广. 现代农药剂型加工技术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2012: 416-422.

【责任编辑 霍 欢】

Preparation and bioactivity determination of azadirachtin-rich dry powder

LI Yiming1， CHEN Xiaotian1， WANG Yongqing1， CHENG Dongmei2， ZHANG Zhixiang1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology/College of Agriculture, South China Agricultural University, Ministry of Education, Guangzhou 510642, China； 2 College of Agriculture, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

【Objective】 To study the biological activity of azadirachtin-rich dry powder, azadirachtin A and azadirachtin B, and establish a method for determinating azadirachtin content of dry powder.【Method】 Azadirachtin-rich dry powder was prepared by ethyl acetate extraction method, the azadirachtin content of dry powder was determined by HPLC and the biological activity was measured by leaf disc test. 【Result】AFC50of zadirachtin-rich dry powder was 0.28 μg·mL-1against 2nd instar larvae ofSpodopteralituraand 70.71 μg·mL-1against the 3rd instar larvae ofPierisbrassicae24 h after treatment. The antifeedant activity of azadirachtin-rich dry powder was clearly higher than that of azadirachtin A and azadirachtin B. 【Conclusion】 This preparation method of the dry powder is simple, effective, and has good biological activity. It is recommended for popularization and application.

azadirachtin-rich dry powder;Spodopteralitura;Pierisbrassicae; ethyl acetate extraction method; leaf disc test; HPLC； bioacitivity

2017- 03- 14 优先出版时间：2017- 06-21

李一鸣(1991—)，女，硕士研究生，E-mail: xysgliyiming@163.com; 通信作者：张志祥(1974—),男，教授，博士，E-mail: zdsys@scau.edu.cn

广东省自然科学基金(2016A030313387)

S482

A

1001- 411X(2017)04- 0048- 004

优先出版网址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1924.016.html

李一鸣， 陈孝甜， 王勇庆， 等.印楝素干粉的制备及生物活性测定[J].华南农业大学学报，2017,38(4):48- 51.