曾 涛，孙思维，田 勇，陈 黎，卢立志，干贤通，干方本，吴春琴，*

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021; 2.温州科技职业学院 动物科学系，浙江 温州 325006; 3.浙江绿雁农业开发有限公司，浙江 乐清325615)

利用微卫星标记分析雁荡土鸡及其他3个鸡群体遗传多样性

曾 涛1，孙思维2，田 勇1，陈 黎1，卢立志1，干贤通3，干方本3，吴春琴2，*

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021; 2.温州科技职业学院 动物科学系，浙江 温州 325006; 3.浙江绿雁农业开发有限公司，浙江 乐清325615)

为探讨浙江省不同地方鸡群体的遗传多样性及遗传距离，促进浙江境内鸡群体遗传资源的合理利用和保护，本试验利用STR分型技术对雁荡麻鸡Ⅰ系、Ⅱ系、萧山鸡、龙游麻鸡和仙居鸡5个群体(440只个体)在28个位点上的遗传多样性进行了检测。结果表明，所有位点在5个群体中的平均有效等位基因(Ne)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)分别为3.709 0、0.664 1和0.621 5，其中龙游麻鸡的平均Ne、He和PIC最高(3.941 9、0.702 2和0.661 3)；仙居鸡最低(3.505 1、0.653 9和0.609 3)；雁荡麻鸡2个品系平均值处于龙游麻鸡和仙居鸡之间(Ⅰ系分别为3.785 5、0.670 6和0.628 8，Ⅱ系分别为3.695 7、0.654 6和0.611 4)。遗传距离和系统聚类结果显示，5个鸡群体聚为3类，雁荡麻鸡2个群体为一类，仙居鸡为一类，萧山鸡与龙游麻鸡为一类。雁荡麻鸡Ⅰ系和Ⅱ系是浙江境内不同于仙居鸡、萧山鸡和龙游麻鸡而单独存在的一个品种。

鸡；微卫星；遗传多样性；遗传距离

微卫星DNA 核心序列重复次数的不同和重复程度的不同导致了每个基因座的多态性[1]，微卫星DNA 或标记因其有数量多、分布广、多态性丰富、呈共显性遗传方式等优点，已经在动物遗传育种中得到广泛应用。目前，全球生物多样性正在下降，研究和保护动物的遗传多样性已成为保护生物学关注的热点。微卫星作为理想的遗传标记，已应用于动物遗传多样性和建立遗传谱系的研究中，推动了保护遗传学的发展。国内外已有多位学者用微卫星标记研究了不同家禽品种的遗传结构、亲缘关系和遗传多样性[2-7]。

雁荡土鸡原产于乐清市雁荡山区一带，是在特定的地理、气候等环境和传统饲养管理方式下，经过长期择优繁育而形成的蛋肉兼用品种。2004年以来，课题组对散养在雁荡山区一带的土鸡进行收集和闭锁继代选育，根据土鸡的羽色和生产性能重点培育了两个品系，分别是Ⅰ系快长型，羽色为黑羽黑脚，生长速度较快；Ⅱ系优质型，羽色为黄麻羽黄脚，生长速度较慢。雁荡土鸡鸡肉品质细嫩，鸡蛋营养价值高，深受当地人们欢迎。本研究选取与雁荡土鸡相近的浙江省本地蛋肉兼用型鸡品种萧山鸡、龙游麻鸡和仙居鸡，进行遗传多样性比较及遗传距离的分析，以揭示雁荡土鸡的遗传特征，为地方鸡品种资源开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验采集浙江省主要的5个鸡(Gallusgallus)群体的血样。5个群体样本信息详见表1。所有群体公母比例为1∶1。

1.2 血液采集及DNA提取

采取翅静脉采血，收集于医用2 mL一次性真空采血管(含抗凝剂)带回实验室，-20 ℃保存备用。使用TaKaRa Blood Genome DNA Extraction Kit提取总DNA。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，用紫外分光光度计法估计含量，稀释DNA样品至 50 ng·μL-1，用于后续微卫星分型分析。

1.3 引物设计及PCR扩增

根据GenBank和相关文献所提供的鸡的SSR序列及引物进行筛选。选择核心重复序列较多，且在多个品种中多态性丰富的位点。最终选取30对引物进行扩增，其中28对引物扩增成功，引物由上海英捷生物有限公司合成，详见表2。

PCR反应体系为15 μL，具体为：10×Buffer 1.5 μL，DNA 1.0 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL，酶0.3 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各0.15 μL，ddH2O补至15 μL。扩增反应程序如下：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃变性15 s，52～65 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，共35个循环；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

表1 各群体样本信息

Table 1 Information of the population sample

品种Breeds样本量Samplesize来源Source雁荡麻鸡Ⅰ系YandangchickenⅠ(YDⅠ)100浙江绿雁农业开发有限公司ZhejiangLvyanAgriculturalDevelopmentCo．，Ltd．雁荡麻鸡Ⅱ系YandangchickenⅡ(YDⅡ)100浙江绿雁农业开发有限公司ZhejiangLvyanAgriculturalDevelopmentCo．，Ltd．萧山鸡Xiaoshanchicken(XS)60杭州萧山东海养殖有限责任公司HangzhouXiaoshanEastSeaAquacultureCo．，Ltd．龙游麻鸡Longyouchicken(LY)60衢州某鸡场AchickenfarminQuzhou仙居鸡Xianjuchicken(XJ)120浙江礼仕得仙居鸡开发有限公司ZhejiangLishideXianjuChickenDevelopmentCo．，Ltd．

表2 鸡微卫星引物信息

Table 2 Microsatellite primers sequences of chicken

座位名称(Loci)染色体Chromosome引物序列Primerssequences退火温度Annealingtemperature/℃ADL1369TGTCAAGCCCATCGTATCACCACCTCCTTCTCCTGTTCA53ADL1665TGCCAGCCCGTAATCATAAAGCACCACGACCCAATCTA55ADL1852CATGGCAGCTGACTCCAGATAGCGTTACCTGTTCGTTTGC60ADL1951AGATGGAAGACAGGACAAATAGCACAGACAATGTTATGC52ADL21011ACAGGGAGGATAGTCACACATGCCAAAAAGATGAATGAGTA55ADL2122TTTCAAAAGTGCCCTCACACTTCCTCCCTAAACTATGCTG52ADL22513CCAAAAAGCTGTATCACCTTGCCTGTTGTAAACCACCTGA59ADL12311GCTGTGTCAAGATTAGAATCACAACAATGAAAAACACTACCTGA53ADL201ZGCTGAGGATTCAGATAAGACAATGGCTGACGTTTCACAGC52ADL1762TTGTGGATTCTGGTGGTAGCTTCTCCCGTAACACTCGTCA52LEI01663AAGCAAGTGCTGGCTGTGCTCTCCTGCCCTTAGCTACGCAC58LEI006614GATCAGATGCATCCAAAGTTCGAAGCAGGAAAATAGAAAAGGC56LEI00944CAGGATGGCTGTTATGCTTCCAGGCCAACCCATACAAGAAAC63MCW02954ATCACTACAGAACACCCTCTCTATGTATGCACGCAGATATCC62MCW00146AAAATATTGGCTCTAGGAAACCGGAAATGAAGGTAAGACTAGC63MCW6710GCACTACTGTGTGCTGCAGTTTGAGATGTAGTTGCCATTCCGAC65MCW00815GTTGCTGAGAGCCTGGTGCAGCCTGTATGTGGAATTACTTCTC63MCW1837ATCCCAGTGTCGAGTATCCGATGAGATTTACTGGAGCCTGCC64MCW294ZACTGAACAGAAACAGTCTTCCCTTCTCTAGATGTCCACTACC63MCW33017TGGACCTCATCAGTCTGACAGAATGTTCTCATAGAGTTCCTGC63MCW00854GTGCAGTTATATGAAGTCTCTCGGTATACAGGGCTTCTGAAACA57MCW2642AGACTGAGTCACACTCGTAAGCTTACTTTTCACGACAGAAGC56MCW1349GGAGACTTCATTGTGTAGCACACCAAAAGACTGGAGGTCAAC58MCW10413TAGCACAACTCAAGCTGTGAGAGACTTGCACAGCTGTGACC64MCW1451ACTTTATTCTCCAAATTTGGCTAAACACAATGGCAACGGAAAC61MCW1503TCCTGACTGAAATGGTACAGCCATGAAAACCTTTGCCCTCAG61MCW325AAGTTCCTTGTACAATTGTTATCATTACTAGTACAATCAAGATGG56MCW43GGATTACAGCACCTGAAGCCAAACCAGCCATGGGTGCAGATTGG64MCW1207CTATGTAAAGCTTGAATCTTCAATTCCTGGGTGCTAATTTACC57MCW1744TGGACTTAACACTGCTATTGCCTCTCTACCTTGGAGGGCTGA54

含荧光标记的PCR产物用ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪检测。上样总体积为10 μL，其中包括已经混有ROX500标准内参的上样液Hi-Di Formamide 9 μL，PCR产物1 μL。

1.4 数据统计分析

采用GeneMapper 4.0导出图谱文件，根据图谱中最大波峰位置判断目标条带的大小，单波峰为纯合子，双峰为杂合子，并生成Excel数据表格。利用microsatellite-toolkit软件计算有效等位基因数目(Ne)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC))。用Popgene32软件进行F-统计量分析，群体Nei氏遗传距离及相似性分析。

2 结果与分析

2.1 微卫星位点检测分型

利用 28对引物分别对440个样本进行PCR扩增，利用ABI-3730XLDNA Analyzer全自动测序仪对所检位点进行毛细管电泳扫描、判读基因型(图1)。

2.2 群体的遗传多样性比较

所有位点在5个群体中的平均He、PIC和Ne分别为0.664 1、0.621 5和3.709 0，其中龙游麻鸡的平均He、PIC和Ne最高(0.702 2、0.661 3和3.941 9)，仙居鸡最低(0.653 9、0.609 3和3.505 1)，雁荡麻鸡2个品系处于龙游麻鸡和仙居鸡之间， 但与两者又具有显著差异(Ⅰ系分别为0.670 6、0.628 8和3.785 5；Ⅱ系分别为0.654 6、0.611 4和3.695 7)(表3)。

2.3 群体间的遗传距离和系统聚类

利用Popgene32软件对5个鸡群体间的Nei氏相似性和遗传距离进行了分析，同时根据遗传距离，采用UPGMA法进行聚类，详见表4和图2。雁荡麻鸡Ⅰ系和Ⅱ系的相似性最高为0.904 9，其次是萧山鸡与龙游麻鸡(0.820 6)；雁荡麻鸡与其他3个品种的相似性高低依次为仙居鸡>龙游麻鸡>萧山鸡；雁荡麻鸡与其他3个品种间的遗传距离大于3个品种内部的遗传距离，说明雁荡麻鸡是属于单独的一个品种；聚类分析显示，雁荡麻鸡2个品系单独聚成一类，与仙居鸡遗传距离小于与萧山鸡和龙游麻鸡的遗传距离，而萧山鸡和龙游麻鸡聚成一类。遗传距离和系统聚类结果均表明，雁荡麻鸡Ⅰ系和Ⅱ系是不同于仙居鸡、萧山鸡和龙游麻鸡而单独存在的一个品种。

图1 位点ADL225的某基因型Fig.1 One of genotyping of ADL225

表3 二十八个微卫星位点在各个群体中的期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)

Table 3 Expected heterozygosities， polymorphism information content and the number of effective alleles of 28 microsatellite loci in each population

位点Loci群体Population雁荡麻鸡Ⅰ系(YDⅠ)雁荡麻鸡Ⅱ系(YDⅡ)萧山鸡(XS)龙游麻鸡(LY)仙居鸡(XJ)平均值MeanADL136He085040836307904089070850708437PIC083220811207568087310830408207Ne753015719346228768546208963533ADL166He079410811308493082490808608176PIC076920781608243079370780707899Ne538655887563293548785133656449ADL185He083980841808153058740381106931PIC081770821207823056040367506698Ne645196756852189239301611644864ADL195He077390721407561082080669407483PIC073620664507056078830606907003Ne387574371539898536072995341186ADL210He062700534907574079640799407030PIC054110490907073076380763906534Ne262471833739950471504840036016ADL212He063420601305595070660686806376PIC060830556005121067810628305966Ne243692828522441333623159728010ADL225He085610802006161087690859008020PIC083440770005658085520839107729Ne619005878925705765426912958413ADL123He052550472702467044700480804345PIC050310444202323041440441304070Ne217461838613238179551918418101ADL201He001990000861000212PIC001960000817000203Ne100001020210000109331000010227ADL176He070330768105549080630729507124PIC064690728704945077390686306661Ne441353757622223498373655938066LEI0166He058400596606453060210463105782PIC050400507205744053000382604996Ne249202442927756248081855824094LEI0066He088300955008990094100945009190PIC071760705407998081830767607617Ne396564505556023619114880650290MCW0295He067880543807556066700668906628PIC061690476007145061040612406060Ne294682367739874295222994830497

续表1

表4 五个鸡群体间的Nei氏遗传相似性系数和遗传距离

Table 4 Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance

品种Breeds雁荡麻鸡Ⅰ系(YDⅠ)雁荡麻鸡Ⅱ系(YDⅡ)萧山鸡(XS)龙游麻鸡(LY)仙居鸡(XJ)雁荡麻鸡Ⅰ系(YDⅠ)∗∗∗∗09049063230716007556雁荡麻鸡Ⅱ系(YDⅡ)01000∗∗∗∗063190689207171萧山鸡(XS)0458404590∗∗∗∗0820606506龙游麻鸡(LY)033400372301977∗∗∗∗ 08082仙居鸡(XJ)02802033250429802130∗∗∗∗

*Nei氏遗传相似性系数(对角线以上)和遗传距离(对角线以下)

Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).

图2 五个鸡群体基于Nei氏遗传距离的UPGMA系统发育聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram of 5 breeds based on Nei’s genetic distance

3 讨论

了解雁荡麻鸡的遗传多样性，有助于中国地方鸡种的选育及开发利用。雁荡麻鸡体躯长方形，体型中等。羽色具有麻鸡的特点，尾羽上翘。按照羽色和胫部皮肤颜色的不同，分Ⅰ系(黑麻羽青脚)、Ⅱ系(黄麻羽黄脚)两个品系，具有丰富的多样性。雁荡麻鸡是雁荡山区独特的家禽资源，体型偏小，抗病力强，肉蛋营养丰富，但目前，该品种尚未经过省遗传资源鉴定，因此有必要了解该品种的遗传特性及其与周边地方鸡种的遗传距离，为今后雁荡土鸡更好地开发提供参考。

由于微卫星标记具有多态丰富、共显性、操作简单等特点，被用于鸡种多样性，以及群体内及群体间的遗传结构和差异研究[8-11]。通过分析遗传杂合度(He)和多态信息含量(PIC)，可以看到不同座位在不同群体中的遗传变异程度不同。从本研究的结果可以看出，28个微卫星座位在5个不同鸡群体，呈现出不同的多态现象。其中，S9的Ne、He和PIC较其他位点稍低，为低度多态位点，其他位点均处于中高度多态位点。5个群体中的平均He、PIC和Ne分别为0.664 1、0.621 5和3.709 0，其中龙游麻鸡的平均He、PIC和Ne最高(0.702 2、0.661 3和3.941 9)，仙居鸡的平均He、PIC和Ne最低(0.653 9、0.609 3和3.505 1)，雁荡麻鸡2个品系的平均He、PIC和Ne处于龙游麻鸡和仙居鸡之间，但与两者又具有显著差异(Ⅰ系He、PIC和Ne分别为0.670 6、0.628 8和3.785 5；Ⅱ系He、PIC和Ne分别为0.654 6、0.611 4和3.695 7)，结果表明,雁荡麻鸡是处于龙游麻鸡和仙居鸡之间的品种。

遗传距离是指不同的种群或种间的基因差异的程度，并且以某种数值进行度量，通常由基因频率的某个函数所确定。遗传距离的信息已作为在决策保种计划时群体结构和品种分化最基本的指标，准确理解遗传距离的概念和在不同的情况下选择合适的度量方式是很重要的。遗传距离是研究物种遗传多样性的基础，它反映了所研究群体的系统分化，一般认为，群体分化时间越短，遗传距离越小。哪种遗传距离测定方法对分析品种遗传变异最好并无定论，不同的遗传距离得出的系统发生树不同[12-13]。本试验得到的聚类图中，5个鸡群体聚为3类，雁荡麻鸡2个群体单独为一类，仙居鸡为一类，萧山鸡与龙游麻鸡为一类。结果表明，雁荡麻鸡Ⅰ系和Ⅱ系是不同于仙居鸡、萧山鸡和龙游麻鸡而单独存在的一个品种。

本研究通过应用28个多态性较好的微卫星标记对浙江省5个鸡群体进行了遗传多样性分析，所得的聚类图能够准确地反映5个群体间的分化关系，各品种的遗传多样性非常丰富，都具有各自的特性，在合理开发利用的同时，要保存其各自优良的品种资源。同时，本研究也发现雁荡麻鸡是不同于仙居鸡、萧山鸡和龙游麻鸡而单独存在的一个品种，应申请省遗传资源鉴定为新的保护品种。

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(责任编辑 张 韵)

Genetic diversity of Yandang chicken and other three chicken populations using microsatellite markers

ZENG Tao1， SUN Siwei2， TIAN Yong1， CHEN Li1， LU Lizhi1， GAN Xiantong3， GAN Fangben3， WU Chunqin2，*

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 2.DepartmentofAnimalScience，WenzhouVocationalCollegeofScienceandTechnology，Wenzhou325006，China; 3.ZhejiangLvyanAgriculturalDepartmentCo.，Ltd.，Yueqing325615，China)

In order to study the chicken populations’ genetic diversity and relationship and promote the rational use and protection of the chicken populations genetic resources in Zhejiang Province， 28 microsatellite loci were tested in the 5 chicken populations， which were Yandang chicken I， Yandang chicken II， Xiaoshan chicken， Longyou chicken and Xianju chicken， totally 440 samples. The results showed that the average effective number of alleles (Ne) was 3.709 0， the average expected heterozygosity (He) was 0.664 1， and the mean polymorphic information content (PIC) was 0.621 5. In addition， the Ne， He and PIC of Longyou chicken were the highest (3.941 9， 0.702 2 and 0.661 3). The Ne， He and PIC of Xianju chicken were the lowest (3.505 1， 0.653 9 and 0.609 3). The Ne， He and PIC of Yandang chicken were between the two populations (Ⅰ: 3.785 5， 0.670 6 and 0.628 8; Ⅱ: 3.695 7， 0.654 6 and 0.611 4). Phylogenetic tree analysis based on Nei’s genetic distance revealed that Yandang chicken (Ⅰ and Ⅱ)， Xianju chicken， Xiaoshan chicken and Longyou chicken was clustered into threes group separately. It indicated that Yandang chicken was a separate breed which is different from Xiaoshan chicken， Longyou chicken and Xianju chicken.

chicken; microsatellite; genetic diversity; genetic distance

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.03

2017-01-12

浙江省农业科技成果转化资金资助项目(2013-101)；温州市种子种苗科技创新专项项目(N20120031)；浙江省科学技术厅重大科技专项重大农业项目(2014C02001)

曾涛(1987—)，男，安徽安庆人，博士，助理研究员，主要从事家禽遗传育种研究。E-mail: zengtao4009@126.com

*通信作者，吴春琴，E-mail: nkywcq@163.com

S831.2

A

1004-1524(2017)07-1070-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1070-1076

曾涛，孙思维，田勇，等. 利用微卫星标记分析雁荡土鸡及其他3个鸡群体遗传多样性[J].浙江农业学报，2017，29(7)： 1070-1076.