洪 莹，王志耕，梅 林，薛秀恒

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽省农产品加工工程实验室，合肥农产品加工研究院，合肥230036)

油脂安全

酶法改性1，3-DG猪脂肪的安全性评价

洪 莹，王志耕，梅 林，薛秀恒

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽省农产品加工工程实验室，合肥农产品加工研究院，合肥230036)

评估酶法改性1，3-DG猪脂肪的安全性，并为其开发利用提供科学依据。依据《食品安全性毒理学评价程序和方法》，以KM小鼠和SD大鼠为受试动物进行急性毒性、遗传毒性试验(包括Ames试验、红细胞微核试验和显性致死试验)以及28 d经口毒性试验。急性毒性试验表明，经口灌胃酶法改性1，3-DG猪脂肪，未见明显异常，LD50>17 g/kg，该物质为无毒级。遗传毒性3项试验结果为阴性，未表现出致突变性。28 d经口毒性试验表明，各剂量组大鼠临床检查正常，体重、进食量、食物利用率、血常规、血生化、脏体比等各项指标均在正常范围内，与空白对照组相比差异不显著(p>0.05)；组织病理学观察并未发现病理改变。研究表明酶法改性1，3-DG猪脂肪是安全无毒的可食用油脂。

1，3-DG猪脂肪；急性毒性；遗传毒性；28 d经口毒性

我国猪肉消费量世界第一[1]，猪脂肪是生猪屠宰加工中的重要产品，是我国传统消费的油脂。现代营养学认为，长期大量食用动物源油脂，会导致血脂升高，易引发肥胖症、脂肪肝、心血管疾病等“富贵病”，对人体健康产生不利的影响[2]。随着人们饮食水平和健康关注程度的提高，猪脂肪资源的利用程度逐渐下降[3]。油脂功能化研究表明，甘油三酯改性为1，3-甘油二酯(1，3-DG)后具有减肥功效[4-6]。1，3-DG产品在美国和日本等国家已实现商业化，并且国内某些高校也对其展开深入研究[7-8]。

为了充分利用猪脂肪资源，本实验室研究建立了一种酶法改性制备1，3-DG猪脂肪的专利技术[9]，获得1，3-DG含量在44%以上的新型猪脂肪产品。动物试验表明，该产品具有控制肥胖、预防高血脂等保健功效。

作为非天然食品材料，工业化推广利用前对其进行安全性评价十分必要。目前，1，3-DG的安全性研究报告仅限于植物油[10-12]，动物源1，3-DG安全性评价鲜见详细报道[13-14]。本研究依据GB 15193—2014《食品安全性毒理学评价程序和方法》系列标准，对酶法改性后的1，3-DG猪脂肪进行急性毒性、遗传毒性及28 d经口毒性试验，旨在为其安全性评估提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1，3-DG猪脂肪(利用酶法改性制备1，3-DG猪脂肪[9]，外观与普通猪脂相比无差异，常温下呈白色固态，样品中1，3-DG含量为44.5%)，由安徽农业大学畜产品加工实验室提供。

鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535，由安徽省疾病预防控制中心毒理学研究所提供。

SPF级KM小鼠、SD大鼠，购于安徽医科大学实验动物中心(动物合格证号：SCXK(皖)2005-001)。饲养环境符合GB 14925—2010《实验动物 环境及设施》标准要求。试验前，试验动物在试验环境(温度20～26℃，湿度40%～70%)中进行5 d预试验观察。

TBA-120FR型全自动生化分析仪，日本东芝医疗系统(中国)有限公司；Mythic22Vet型动物血细胞分析仪，上海康美医疗器械有限公司；Allegra 64R型台式高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；RM-2016型轮转切片机，德国徕卡有限公司；B203LED型生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；Olympus倒置显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司；Giemsa染液，上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清，赛默飞世尔科技公司；丙氨酸氨基转移酶，总胆固醇、甘油三酯等测定试剂盒，均购于长春汇力生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 急性毒性试验

选用5～6周KM小鼠(18～22 g)40只，随机分成2组，每组20只，雌雄各半。灌胃前，受试小鼠禁食6 h，自由饮水。采用经口灌胃，灌胃剂量为20 mL/kg(按体重计)，一次性给予，空白对照组小鼠给予相同体积的蒸馏水。灌胃完毕2 h给予小鼠普通饲料，自由饮食、饮水。试验期间，观察并记录小鼠一般临床表现及死亡情况。

1.2.2 遗传毒性试验

1.2.2.1 Ames试验

试验菌株为经过鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535。试验采用平板掺入法。受试物灭菌后，设8、40、200、1 000、5 000 μg/皿5个组，同时设空白对照组、溶剂对照组(二甲基亚砜)和阳性对照组(2-氨基芴、1，8-二羟基蒽醌、敌克松、叠氮化钠、2-氨基蒽)，每种菌株每个测试浓度设3皿平行，在加S9和不加S9条件下进行试验，计数回复突变菌落数，以超过溶剂对照组回复突变菌落数的2倍且有剂量-反应关系作为阳性判断标准。

1.2.2.2 红细胞微核试验

选用7～8周KM小鼠(18～22 g)50只，随机分成5组，每组10只，雌雄各半。设低、中、高3个受试物剂量组，即2.5、5.0、10.0 g/kg，空白对照组(玉米胚芽油，10.0 g/kg)，阳性对照组(环磷酰胺水溶液，40 mg/kg)。各灌胃组剂量一致，以玉米胚芽油补足。本试验采用30 h给予受试物法，第一次给予受试物24 h后，第二次给予受试物，6 h后采集骨髓样品，制片，Giemsa染液染色。选择细胞完整、分散均匀区域，在油镜下观察计数1 000个嗜多染红细胞(PCE)中的微核数，并计算微核率。

1.2.2.3 显性致死试验

选用6～7周KM雄鼠(30～35 g)75只，随机分成5组，每组15只，并每组提供雌鼠6×30只(分6周提供)，受试物剂量组、空白对照组和阳性对照组按1.2.2.2 中给予。本试验雄鼠连续灌胃5 d后，再将雄鼠与雌鼠按1∶2比例同笼交配，检查阴栓确定交配成功后，取出雌鼠。间隔2 d后雄鼠再与第二批雌鼠同笼，如此共交配6批雌鼠。受孕鼠在16 d时处死，剖腹观察并记录受孕率、平均着床数、平均死亡胚胎数、胚胎死亡率等。

1.2.3 28 d经口毒性试验

选用5～6周SD大鼠(60～70 g)40只，随机分成4组，每组10只，雌雄各半。以中国膳食指南推荐成人(60 kg计)每天油脂摄入量25 g(0.42 g/kg)为依据，分别设10、20倍和30倍剂量为低、中、高3个受试物剂量组，即4.2、8.3 g/kg和12.5 g/kg，空白对照组给予玉米胚芽油。每天定时给各组按照12.5 g/kg剂量灌胃，连续灌胃28 d，试验期间大鼠单笼喂养，自由进食、饮水，观察大鼠的一般临床表现，每周记录大鼠的体重以及饲料消耗量。试验结束时，禁食过夜12 h，采用眼球采血法收集血液样本，进行血常规、血生化指标检测。解剖动物，称量并计算脏体比；取动物的心、肝、脾、肺、肾，进行组织病理学检查[15]。

1.2.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

每次灌胃完毕后，小鼠出现活动量减少，部分出现皮毛成簇的现象，但数分钟后恢复正常，灌胃引发小鼠一定刺激反应[16]。14 d内试验组和空白对照组小鼠无一例死亡，表征、活动、饮水、排便均正常。由此可见，本研究1，3-DG猪脂肪经口LD50>17 g/kg，根据急性毒性剂量分级标准，1，3-DG 猪脂肪属于实际无毒，初步判断属安全、无毒物质。

2.2 遗传毒性试验

2.2.1 Ames试验(见表1)

表1 Ames试验结果

由表1可知，在加或不加S9的条件下，不同剂量受试物的回复突变菌落数与溶剂对照组相近(p>0.05)，并均未达到溶剂对照组的2倍，但阳性对照物显示出明显的诱变性(p<0.05)。结果表明在试验剂量范围内，在加或不加S9的条件下，1，3-DG 猪脂肪对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型5株菌株均无致突变作用。

2.2.2 红细胞微核试验(见表2)

表2 1，3-DG猪脂肪对小鼠红细胞微核试验结果

由表2可知，各剂量组与空白对照组相比均无显著性差异(p>0.05)，与阳性对照组比有显著性差异(p<0.05)。由此可得，1，3-DG猪脂肪无诱使小鼠红细胞微核增加的作用。

2.2.3 显性致死试验(见图1)

由图1可知，该1，3-DG猪脂肪对6批雌鼠的受孕率、平均着床数、胚胎死亡率和平均死亡胚胎数等均未造成明显影响，受试物对雌鼠各个阶段的生殖细胞均无致突变作用。而环磷酰胺阳性组，对6批雌鼠的死亡胚胎数有一定影响，其中1～4批平均死亡胚胎数显著增加，平均着床数减少，这可能是由于环磷酰胺对试验雄鼠的精细胞和精子有一定程度的影响；但随着批数增加胚胎死亡率呈下降趋势，可能是畸变恢复的作用；每批受孕率均相对下降，可能是环磷酰胺对试验雄鼠的精原细胞和精母细胞已产生影响。畸变的雌、雄生殖细胞的结合而形成的受精卵通常不具备正常生理功能，表现出胚胎早死和平均着床数下降。

注：受孕率=受孕雌鼠数/交配雌鼠数×100%；平均着床数=总着床数/受孕雌鼠数；胚胎死亡率=死亡胚胎数/总着床数×100%；平均死亡胚胎数=死亡胚胎数/受孕雌鼠数。

图1 显性致死试验结果

2.3 28 d经口毒性试验

2.3.1 临床反应结果

试验期间，各组试验大鼠表征、精神状态、饮水以及排便等未发生明显的异常，无大鼠死亡。

2.3.2 1，3-DG猪脂肪对大鼠每周体重和食物利用率的影响(见表3)

由表3可知，大鼠体重增长变化正常，各剂量组雌、雄性大鼠体重与空白对照组无显著差异(p>0.05)。但每周称重，各组雄性大鼠体重均显著高于雌性大鼠体重(p<0.05)，这与林梁鹏等[17]试验结果一致。由此可见，1，3-DG猪脂肪对大鼠体重无明显的影响。

1，3-DG猪脂肪对大鼠体重增长、进食量、食物利用率的影响表明，各剂量组与空白对照组无显著差异(p>0.05)，1，3-DG猪脂肪的摄入对大鼠饮食和食物利用率无明显影响。

表3 1，3-DG猪脂肪对大鼠每周体重和食物利用率的影响

2.3.3 1，3-DG猪脂肪对大鼠血常规指标的影响(见表4)

由表4可知，各剂量组的各项血液学指标与空白对照组无显著性差异(p>0.05)，并且测定值均在正常参考范围内，表明1，3-DG猪脂肪对大鼠未造成血液学指标的毒理学改变。

表4 1，3-DG猪脂肪对大鼠血常规指标的影响

2.3.4 1，3-DG猪脂肪对大鼠血生化指标的影响(见表5)

由表5可知，雄性高剂量组TG、TC数值显著高于空白对照组(p<0.05)；雌性高剂量组的TG数值显著高于其他组别(p<0.05)，而各组TC无显著差异(p>0.05)，并且其值均在正常值范围内(TG：雄0.21～1.99 mmol/L，雌0.23～1.98 mmol/L；TC：雄1.28～4.12 mmol/L，雌1.02～4.66 mmol/L)[18-19]。其他血液生化指标各组间无显著性差异(p>0.05)。本研究中，血清中反映肝脏功能的主要指标ALT、AST与空白对照组均无显著差异(p>0.05)，说明对肝脏功能无影响；反映肾脏功能的主要指标CR与空白对照组无显著性差异(p>0.05)，也无剂量-效应关系，并且测定值均在正常参考范围内。因此，1，3-DG猪脂肪对大鼠血生化指标无不良影响。而高剂量组引起大鼠TG、TC(雄性)数值的显著升高，推测是因为本试验1，3-DG猪脂肪28 d超标准灌入30倍剂量该油脂，大鼠的能量摄入量太多，致使血液的TG、TC数值呈显著升高变化，也提示1，3-DG仅具有辅助降血脂、降胆固醇功效。

表5 1，3-DG猪脂肪对大鼠血生化指标的影响

2.3.5 1，3-DG猪脂肪对大鼠主要脏器脏体比的影响(见表6)

由表6可知，雄性大鼠高剂量组的肝体比显著高于空白对照组和低剂量组(p<0.05)，但其他脏器未发现显著性差异(p>0.05)。部分大鼠肝上少许脂肪粒，可能是1，3-DG猪脂肪摄入量过多导致。这种现象只在雄性大鼠中发现，其他各剂量组的脏体比与空白对照组无显著差异(p>0.05)。雌性大鼠各组间无显著性差异(p>0.05)。并且各组大鼠的脏体比均在正常范围内。试验结果表明，1，3-DG猪脂肪的摄入对大鼠脏器未产生不利影响。

表6 1，3-DG猪脂肪对大鼠主要脏器脏体比的影响

2.3.6 主要脏器组织学病理检查

解剖观察各剂量组和空白对照组大鼠主要脏器均未发现明显的脏器病变，但高剂量组2只雄性大鼠肝脏上出现白色脂肪粒，所以选择各组高剂量组和空白对照组雌雄大鼠进行组织病理学检查。结果表明，高剂量组和空白对照组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、睾丸和卵巢等组织结构清晰，未出现明显镜检差异和病理特征。

3 结 论

急性毒性试验结果表明，小鼠经口灌胃1，3-DG猪脂肪，未发现明显异常，LD50>17 g/kg，故1，3-DG猪脂肪为安全、无毒物质。

根据对遗传物质作用终点的差别，并兼顾原核细胞与真核细胞、体内试验与体外试验以及体细胞和生殖细胞相配套原则，进行了3项遗传毒性试验，即Ames 试验、哺乳动物红细胞微核试验、啮齿类动物显性致死试验。Ames试验主要是针对生物的基因突变进行评估；哺乳动物红细胞微核试验主要是对染色体结构完整性变化进行评估；啮齿类动物显性致死试验主要是对生殖细胞的遗传毒性进行评估。试验结果表明3项遗传毒性试验结果皆为阴性，未表现出致突变性。

28 d经口毒性试验结果表明，各剂量组的大鼠临床检查正常，体重、进食量、食物利用率、血常规、血生化、脏体比等各项指标均在正常范围内，与空白对照组相比，差异不显著(p>0.05)；组织病理学观察未发现病理改变。

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Safety assessment of enzymatic modification of 1，3-DG pig fat

HONG Ying， WANG Zhigeng， MEI Lin， XUE Xiuheng

(Hefei Institute of Agricultural Products Processing， Engineering Laboratory of Agricultural Products Processing of Anhui， School of Tea and Food Science & Technology，Anhui Agriculture University， Hefei 230036， China)

The safety of enzymatic modification of 1，3-DG pig fat was evaluated so as to provide scientific basis for its exploitation and utilization. According toProceduresandMethodsintheFoodToxicologicalSafetyEvaluation， a series of toxicological studies on the ingestion of 1，3-DG pig fat were conducted， including acute toxicity test， genetic toxicity tests (Ames test， erythrocyte micronucleus test and dominant lethal test)and twenty-eight days oral toxicity test with SD rats and KM mice as test animals. The results of acute toxicity test showed that there was no obviously abnormal in mice orally given of 1，3-DG pig fat and the lethal dose (LD50) was more than 17 g/kg， so it belonged to non-toxic class. The results of genetic toxicity tests were negative and it showed no mutagenicity. The results of twenty-eight days oral toxicity test showed that the growth development and behavior of the mice were normal， and the indexes including weight， food intake， food utilization， blood count， biochemical test and organ-body ratio in treatment groups were in normal ranges, which had no significant difference from those in control group(p>0.05). There was no abnormality in the test of organ histopathology. The research indicated that enzymatic modification of 1，3-DG pig fat was a kind of edible oil without toxicity.

1，3-DG pig fat; acute toxicity; genetic toxicity; twenty-eight days oral toxicity

2016-08-02；

2016-12-09

安徽省试验区和试点省专项(12Z0102032)

洪 莹(1991)，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品与食品风味化学(E-mail)hongying825@163.com。

王志耕，教授(E-mail)wzhg@ahau.edu.cn。

TS221；TS225.6

A

1003-7969(2017)05-0085-07