谢蓝华，陈 佳，张淑谊，林茂森，陈云峰，陈 军， 杜 冰

(1.普洱联众生物资源开发有限公司 欧米伽膳食养生产业研究中心，云南 普洱 665008；2.华南农业大学 食品学院，广州 510642 )

油料蛋白

美藤果蛋白的提取工艺及氨基酸组成分析

谢蓝华1，陈 佳1，张淑谊2，林茂森1，陈云峰1，陈 军1， 杜 冰2

(1.普洱联众生物资源开发有限公司 欧米伽膳食养生产业研究中心，云南 普洱 665008；2.华南农业大学 食品学院，广州 510642 )

以美藤果蛋白提取率为考察指标，在单因素实验的基础上，采用正交实验优化了碱溶酸沉法制备美藤果蛋白的工艺条件，并分析了美藤果蛋白的氨基酸组成。结果表明，美藤果蛋白的最优提取工艺条件为∶料液比1∶30，碱提时间2 h，碱提温度70℃，碱提pH 9.0。在最优条件下，美藤果蛋白提取率为83.91%。美藤果蛋白的氨基酸组成种类齐全，必需氨基酸含量较高，是一类较优质的植物蛋白质资源。

美藤果蛋白；提取工艺；氨基酸组成

美藤果，学名南美油藤，属大戟科多年生木质藤本植物，生长于海拔200～1 500 m的南美洲安第斯山脉地区热带雨林，在秘鲁、厄瓜多尔等地区已有上千年的食用历史，是该地区国宝级天然食用植物[1-2]。美藤果营养丰富，富含油脂、蛋白质和维生素E及钙、磷、铁等矿物质，在预防心血管疾病、促进骨骼生长及神经系统发育、美容与抗衰老等方面具有重要作用[3-4]。目前，国内对美藤果研究处于起步阶段，大部分研究针对的是美藤果油的营养成分分析以及在食品和护肤领域的应用[5-6]，美藤果蛋白在国内的研究与应用鲜见报道。本文以云南普洱产的美藤果为原料，采用碱溶酸沉法[7-8]提取美藤果蛋白，并对其氨基酸组成进行分析与评价，为美藤果的综合开发利用探索新的途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料

美藤果种子，由普洱联众生物资源开发有限公司提供；硫酸钾、五水硫酸铜、浓硫酸、N-乙酰苯胺、硼酸、溴甲酚绿、甲基红、氢氧化钠、盐酸、硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、95%乙醇、磷酸，均为分析纯。

PL203型电子精密天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；PHS-3C数字pH计；HH-6型数显恒温水浴锅；Anke TDL-5-A型离心机；DGG-9070B型电热恒温鼓风干燥箱；721G-100可见分光光度计；KDN-08C半自动凯氏定氮仪；L-8900氨基酸自动分析仪，日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 美藤果仁的预处理

美藤果种子在50℃下干燥4 h，剥壳得到美藤果仁，美藤果仁再经粉碎，过60目筛，室温下在压力60 MPa下压榨4 h，压榨2次，得到美藤果粕，粉碎，过40目筛，得到美藤果粕粉，于冷库4℃保存备用。

1.2.2 美藤果蛋白的提取工艺流程

美藤果粕粉→碱提→离心(3 000 r/min，10 min)→取上清液→酸沉(调pH至蛋白质等电点附近)→离心(3 000 r/min，10 min)→取下层沉淀→恒温干燥→美藤果蛋白。

精确称取一定量的美藤果粕粉，加少量不同pH的碱液浸没样品，在一定料液比、一定温度下提取一定时间后，在3 000 r/min下离心10 min，取上清液调pH至蛋白质等电点附近，再将样品溶液于3 000 r/min转速离心10 min，取下层沉淀，在60℃恒温干燥6 h，得到美藤果蛋白。美藤果蛋白提取率的计算公式如下：

美藤果蛋白提取率=提取液中蛋白质含量/美藤果粕粉中蛋白质含量×100%

1.2.3 成分含量测定

水分按照GB/T 21305—2007的方法测定；粗蛋白质按照 GB/T 5511—2008的方法测定；水溶性蛋白参照罗群[9]的考马斯亮蓝法测定:以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，绘制蛋白质标准曲线，建立回归方程为y=0.007 1x+0.001 2，R2=0.998 8，式中y为吸光度，x为蛋白质的质量浓度；氨基酸组成及含量按GB/T 5009.124—2003方法测定，不考虑色氨酸的检测。

1.2.4 美藤果蛋白等电点的测定

称取10 g样品，料液比为1∶30，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.5，在碱提温度70℃下浸提1 h 后，离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液。分别取上清液7份各40 mL，加0.1 mol/L盐酸溶液调pH分别为3.0、3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4，经3 000 r/min离心10 min，弃上清液后恒温干燥至恒重，绘出美藤果蛋白沉淀量与pH的曲线图，图中沉淀量最大时的pH为美藤果蛋白的等电点。

1.2.5 数据处理与统计

正交实验结果采用Minitab 16.0软件处理，其他实验结果采用Excel软件处理。

2 结果与分析

2.1 美藤果仁的水分和粗蛋白质含量

干燥后美藤果仁的水分平均含量为5.74%，粗蛋白质平均含量为32.2%，高于花生(24.8%)、杏仁(22.5%)、核桃(14.9%)和松子(12.6%)，稍低于大豆(35.0%)[10]。

2.2 美藤果蛋白的等电点(见图1)

图1 美藤果蛋白沉淀量与酸沉pH的关系

由图1可知，美藤果蛋白沉淀量在pH 3.8时最大，高于或低于此pH时蛋白沉淀量都减少，而且下降趋势明显，故美藤果蛋白等电点为pH 3.8。

2.3 美藤果蛋白提取单因素实验

2.3.1 料液比对美藤果蛋白提取率的影响

称取3.00 g美藤果粕粉7份，按不同料液比加入碱液，在碱提pH 8.5、碱提温度70℃下提取1 h，测定提取液中美藤果蛋白的含量，研究料液比对美藤果蛋白提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对美藤果蛋白提取率的影响

由图2可知，料液比为1∶10时，溶液的黏度较大，分子扩散速率低，导致体系分散不均匀，从而影响了浸提液对蛋白质的提取；随着料液比的增加，提取率快速升高。当料液比达到1∶30时，美藤果蛋白的提取率达到最大，随后进一步提高碱液的比例，美藤果蛋白的提取率变化不大。故从经济角度出发，选择料液比1∶30较为适宜。

2.3.2 碱提pH对美藤果蛋白提取率的影响

称取3.00 g美藤果粕粉7份，在料液比1∶30的条件下，用1%氢氧化钠溶液调整提取液的pH，于碱提温度70℃下提取1 h，测定提取液中美藤果蛋白的含量，研究碱提pH对美藤果蛋白提取率的影响，结果见图3。

图3 碱提pH对美藤果蛋白提取率的影响

由图3可知，当碱提pH为9.0时，美藤果蛋白提取率达到最大，随后随着碱提pH的升高，提取率有所降低，且提取液中有异味产生。这是因为在pH小于7.0的提取液中，美藤果蛋白等电点与其接近，溶解度小；而在碱性环境(pH 7.0～9.0)中则发生酸式解离使其本身带负电荷，蛋白质分子间互相排斥，分散性好，溶解性好，而且碱液对蛋白质分子的次级键特别是氢键具有破坏作用，使蛋白质分子表面具有相同的电荷，从而对蛋白质分子有增溶作用，这种增溶作用随着pH的升高而增大；但当pH大于9.0时，蛋白质过度水解或变性沉淀，提取率降低，同时氨基酸之间可能发生缩合反应，生成了异味物质[11]。且有研究[12]表明，碱性太强可引起脱氨、脱羧，引起胱赖反应，将氨基酸转变为有毒化合物。故碱提pH取9.0为宜。

2.3.3 碱提温度对美藤果蛋白提取率的影响

称取3.00 g美藤果粕粉7份，在料液比1∶30、碱提pH 8.5的条件下，分别于不同碱提温度下提取1 h，测定提取液中美藤果蛋白含量，研究碱提温度对美藤果蛋白提取率的影响，结果见图4。

图4 碱提温度对美藤果蛋白提取率的影响

由图4可知，随着碱提温度的升高，美藤果蛋白提取率相应提高。碱提温度超过70℃后，提取率变化幅度较小，甚至有所降低。这是由于碱提温度较低(40～70℃)时，温度升高使蛋白质分子的构象发生轻微改变，分子的立体结构变得伸展，有利于蛋白质分子和水分子的运动及其相互作用，温度的升高对蛋白质溶解起到了增溶作用；但当碱提温度高于70℃时，维持蛋白质空间构象的次级键被破坏，引起天然构象解体，把原来在分子内部的一些疏水基团暴露到分子表面，促进了蛋白质分子间的相互结合而凝结沉淀[13]。故碱提温度以70℃为宜。

2.3.4 碱提时间对美藤果蛋白提取率的影响

称取3.00 g美藤果粕粉7份，在料液比1∶30、碱提pH 8.5、碱提温度70℃的条件下，分别提取不同时间后，测定提取液中美藤果蛋白的含量，研究碱提时间对美藤果蛋白提取率的影响，结果见图5。

图5 碱提时间对美藤果蛋白提取率的影响

由图5可知，随着碱提时间的延长，提取率先增加后降低，总体变化幅度较小。说明碱提时间对美藤果蛋白提取率的影响较小。当碱提时间超过2 h后，蛋白质溶出率达到动态平衡。同时综合其他因素对美藤果蛋白的影响，碱提时间为2 h时可以得到较佳的提取率。

2.4 美藤果蛋白提取正交实验

在单因素实验的基础上，选择料液比、碱提时间、碱提pH和碱提温度为因素，美藤果蛋白提取率为指标，进行L16(45)正交实验优化碱溶酸沉法提取美藤果蛋白的工艺条件。正交实验因素水平见表1，正交实验设计及结果见表2。

表1 正交实验因素水平

表2 正交实验设计及结果

从表2可以看出，影响美藤果蛋白提取率的因素主次顺序是：A>C>D>B，即料液比对美藤果蛋白提取率影响最大，影响最小的是碱提时间。综合比较分析，A3B3C3D2为美藤果蛋白提取工艺的最优水平组合，即：料液比1∶30，碱提时间2 h，碱提pH 9.0，碱提温度70℃。

根据正交实验得出的美藤果蛋白提取最佳工艺条件进行3次验证实验，提取率平均值为83.91%，均高于单因素实验结果和正交实验结果，表明此工艺具有一定的合理性。

2.5 美藤果蛋白氨基酸组成分析

美藤果蛋白与常见种仁蛋白氨基酸组成比较见表3。从表3可知，美藤果蛋白氨基酸总量高于大豆、花生和杏仁，是核桃和松子的3倍多；美藤果蛋白必需氨基酸含量高于大豆、花生和杏仁，分别是核

桃和松子的3倍多和4倍多。美藤果蛋白氨基酸总量、必需氨基酸总量在6种种仁蛋白中都是最高的，所以美藤果仁具有较高的营养价值。同时谷氨酸、甘氨酸、精氨酸和天冬氨酸在美藤果蛋白中含量较高，谷氨酸具有健脑作用，能促进脑细胞呼吸，有利于脑组织中氨的排出。精氨酸具有促进胰岛素生成及分泌的作用，可以促进生长发育、创伤愈合及氮储存，还能刺激胸腺增加细胞免疫功能，精氨酸也是精子蛋白的主要成分，有促进精子的质量，提高精子运动能量的作用[14]。

表3 美藤果蛋白与常见种仁蛋白氨基酸组成比较 %

注：*为必需氨基酸。

为了进一步分析美藤果的营养价值，根据文献[15]营养价值评定方法将美藤果必需氨基酸含量与 FAO/WHO 氨基酸标准模式及鸡蛋蛋白必需氨基酸进行比较，结果见表4。

表4 美藤果蛋白必需氨基酸含量与FAO/WHO氨基酸标准模式及鸡蛋蛋白必需氨基酸的比较

注：AAS为氨基酸评分，CS为化学评分。

根据表4中的AAS可知，美藤果蛋白的限制性氨基酸为蛋氨酸+半胱氨酸，评分最高的是缬氨酸。根据CS可知，美藤果的第一限制性氨基酸为蛋氨酸+半胱氨酸，评分最高的是苏氨酸。

3 结 论

本研究确定了美藤果蛋白的最佳碱提工艺条件为料液比1∶30、碱提时间2 h、碱提温度70℃、碱提pH 9.0。在最佳工艺条件下，美藤果蛋白提取率达到83.91%。

美藤果仁中蛋白质和氨基酸含量均很高，必需氨基酸含量高于大豆、花生、杏仁、核桃和松子，低于FAO/WHO氨基酸标准模式，其中蛋氨酸+半胱氨酸是美藤果蛋白第一限制性必需氨基酸。

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Extraction process and amino acid composition of Sacha Inchi protein

XIE Lanhua1, CHEN Jia1, ZHANG Shuyi2,LIN Maosen1, CHEN Yunfeng1, CHEN Jun1, DU Bing2

(1. Research Center of Omega Dietary Health Industry, Puer Lianzhong Biological Resources Development Co., Ltd., Puer 665008, Yunnan, China； 2.College of Food, South China Agricultural University, Guangzhou 510642,China)

Based on single factor experiment, the preparation conditions of Sacha Inchi protein by alkali extraction and acid precipitation were optimized by orthogonal experiment with extraction rate as index, and amino acid composition of Sacha Inchi protein was also analyzed. The results showed that the optimal extraction conditions of Sacha Inchi protein were obtained as follows: ratio of solid to liquid 1∶30, alkali extraction time 2 h, alkali extraction temperature 70℃, alkali extraction pH 9.0.Under these conditions, the extraction rate of Sacha Inchi protein reached 83.91%. The Sacha Inchi protein contained relatively complete amino acid composition and it was rich in essential amino acids. The Sacha Inchi protein was a kind of valuable vegetable protein resource.

Sacha Inchi protein; extraction process; amino acid composition

2016-07-11;

2016-11-24

云南省科技计划项目(2014XB037)

谢蓝华(1987)，男，工程师，硕土，研究方向为食品生物技术(E-mail)xielanhua5858@126.com。

杜 冰，副教授(E-mail)gzdubing@163.com。

TS229;TQ936

A

1003-7969(2017)05-0040-05