陈香君 俸婷婷 杨周洁 管静 王慧娟 赵丹 赵致 周英*

1. 贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025 2. 贵州省中药民族药创制工程中心，贵州 贵阳 550025 3. 贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025 4. 贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025

大血藤为我国特有植物，系木通科藤本植物大血藤Sargentodoxa Cuneata(Oliv.)Rehd. et Wils.的茎，分布于河南、江苏、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、四川等省。大血藤为传统中药材，性味苦平，具有清热解毒、活血通络、祛风止痉等作用[1]。据文献报道大血藤具有较强的抗氧化能力，主要与其所含的大量酚类化合物有密切关系[2]。目前，大量研究已经证实氧化应激在骨质疏松(osteoporosis，OP)发生发展中起重要作用，抗氧化剂可以直接清除体内的自由基或提高内源性抗氧化物质的水平，从而抑制生物大分子的过氧化损伤[3]，利用抗氧化剂来防治OP已成为研究热点。对此笔者选用1，1二苯基苦基苯肼(DPPH)、Fe3+还原能力(FRAP)和2，2-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)二铵盐(ABTS)分别对大血藤醇提物不同极性部位的体外抗氧化活性进行了评价，并直接作用于过氧化氢诱导的成骨细胞氧化应激模型，以MC3T3-E1Subclone 14细胞的存活率、超氧化物歧化酶的活性以及细胞总抗氧化能力为指标，初步研究了大血藤不同极性部位对MC3T3-E1Subclone 14细胞的保护作用及可能的作用机制，为下一步筛选抗骨质疏松活性成分奠定实验基础，同时也为探求开发大血藤资源的新用途奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞

MC3T3-E1Subclone 14小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14，购自中国科学院细胞库。

1.2 仪器

RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；LGJ-12型冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；1510型酶标仪(Thermo)；96孔酶标板(美国Corning Costar )；移液枪(Thermo)；3111型CO2培养箱(Thermo)。

1.3 药物与试剂

大血藤(成都市益诚药业有限责任公司，批号：141001，产地：四川)；1，1-二苯基苦基苯肼( 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH )，2，4，6-三吡啶基三嗪，ABTS，抗坏血酸均购自Sigma公司；三氯化铁、硫酸亚铁、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亚砜、冰醋酸、乙酸钠、过硫酸钾、过氧化氢等均为国产分析纯；成骨细胞α-MEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；青、链霉素(Solarbio公司)；MTT(GENVIEW公司)；超氧化物歧化酶测定试剂盒、总抗氧化能力测定试剂盒(南京建成)。

1.4 实验方法

1.4.1大血藤极性部位的制备：干燥的大血藤药材200 g粉碎，用10倍量的80%乙醇回流提取3次，合并药液并将其浓缩至无醇味稠膏，加适量水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，经减压浓缩、冷冻干燥后，得到石油醚萃取部位0.814 g、乙酸乙酯萃取部位2.206 g、正丁醇萃取部位7.024 g、水萃取部位12.12 g，取不同极性溶剂萃取物，用DMSO溶解，配制成适宜浓度的溶液，备用。

1.4.2清除DPPH自由基活性实验：(1)DPPH溶液的配制。准确称取19.7 mg DPPH，用无水乙醇溶解，定容到50 mL，于4℃下保存，用时移10 mL DPPH储备液，用无水乙醇稀释到100 mL，制成浓度为0.1 mmol/L的供试液。(2)DPPH测定方法。参考文献[4-5]，在 96 孔板中精密加入等体积不同浓度的待测样品溶液和0.1 mmol/L的DPPH溶液，反应体系为300 μL，将其混匀后，室温下避光反应30 min，于517 nm波长下测定吸光度，VC作为阳性对照，实验平行测定3次。DPPH 自由基的清除率(%)，其计算公式为：清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%，A0为DPPH溶液和DMSO混合液的吸光度，Ai为样品和DPPH混合液的吸光度，Aj为样品和无水乙醇混合液的吸光度。

1.4.3还原Fe3+能力测定：(1)TPTZ 工作液的配制。将0.3 mol/L醋酸钠缓冲溶液(调至pH为3.6)，0.01 mol/L2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)溶液(溶解在0.04 mol/L的HCl中)和0.02 mol/L三氯化铁溶液，以10∶1∶1(v∶v∶v)的比例混合，配制成TPTZ工作液。(2)测定方法。参照文献[4-5]，在96孔板中分别精密加入等体积样品溶液和TPTZ工作液，反应体系为300 μL，混匀后，37 ℃避光反应10 min，在593 nm下测定吸光度，以VC做阳性对照，以上实验平行测定3次。还原性由反应后的A表示，A=Ai-Aj-A0，A0为三蒸水的吸光度，Ai为样品溶液反应后的吸光度，Aj为样品溶液的吸光度。以FeSO4标准溶液表示，样品总抗氧化能力表示为每克提取物干重中相当于FeSO4的毫摩尔数(mmol/g)。(3)标准曲线的测定。将亚硫酸铁(FeSO4·7H2O)溶液配制成0.02 mmol/L、0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、0.32 mmol/L，按1.4.2方法测定吸光度，得到标准曲线：Y=6.8356X-0.0044，R2=0.9999。

1.4.4ABTS自由基清除能力测定：(1)ABTS自由基工作液的配制。精密称定0.3841 g ABTS和0.0662 g K2S2O8于烧杯中，并用三蒸水定容至100 mL，使得ABTS的终浓度为7 mmol/L，过硫酸钾的终浓度为2.45 mmol/L。将混合液在常温下暗处放置12～16 h，使用前用无水乙醇稀释，使其在734 nm波长下吸光度为(0.70±0.02)的ABTS+·工作液。(2)测定方法。参考文献[4-5]，以VC为阳性对照，向96孔板中等体积加入不同浓度样品溶液和 ABTS+·工作液，反应体系为300 μL，震荡10 s，静置10 min，在 734 nm 波长处测定样品的吸光度(Ai)；用DMSO代替样品溶液测定空白吸光度(A0)；以无水乙醇代替ABTS混合液测定样品本底吸光度(Aj)；每个浓度做3个平行，取其平均值。ABTS自由基的清除率(%)，其计算公式为：清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

1.4.5成骨细胞实验：(1)成骨细胞的培养及鉴定。将成骨细胞用含10%胎牛血清的α-MEM培养液中培养，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，待细胞长成致密单层，铺满培养皿底，每板加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶消化，显微镜下观察细胞，30 s～1 min细胞成收缩成圆形，弃去消化液，加适量培养液终止消化，吹打培养板底，使细胞脱落，计数，制成细胞悬液，接种于培养板，置于培养箱中培养，备用。MC3T3-E1Subclone 14细胞在含有诱导剂50 μg/mL L-抗坏血酸、10 mmol/mL β-甘油磷酸钠、10-8mol/mL地塞米松的成骨细胞α-MEM全培养基中分别培养7 d和14 d，采用改良的钙钻法[6]和茜素红染色法[7]进行碱性磷酸酶染色及矿化结节染色，在显微镜下大体观察，并采集照片。(2)氧化应激细胞模型的建立。待细胞贴壁后，将不同浓度的H2O2作用于MC3T3-E1Subclone 14细胞，选择合适的H2O2作用浓度，建立氧化应激模型，用于后续研究。将细胞以每孔1×104个接种至96孔板内，待细胞贴壁后，分别给予800 μM/L、900 μM/L、1000 μM/L、1100 μM/L、1200 μM/L H2O2，作用1 h，通过MTT比色法来筛选合适的H2O2作用浓度。(3)大血藤各极性部位对成骨细胞的影响。待细胞贴壁后，更换含药培养基，使大血藤各极性部位的终浓度分别为0.8 mg/L、4 mg/L、20 mg/L，另设对照组常规培养。分别培养24 h、48 h后，利用MTT比色法测定吸光度值A，按公式计算细胞生存率：细胞存活率(%)=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。(4)大血藤各极性部位对H2O2损伤成骨细胞的保护作用。实验分为对照组、模型组和处理组。对照组细胞按常规方法培养，模型组细胞用不含药培养液培养，后用H2O2终浓度为1 mM/L的培养液处理1 h。处理组细胞分别用终浓度为0.8 mg/L、4 mg/L、20 mg/L各极性部位预处理24 h后，吸弃培养液，PBS冲洗1次后，加入H2O2终浓度为1 mmol/L的培养液，处理1 h后，MTT检测吸光值。(5)超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定。用H2O2和大血藤各极性部位处理后，吸弃培养液，PBS洗1遍，加入0.1%的Triton-X 100裂解液50 μL，4℃裂解30 min。操作按试剂盒说明书进行。SOD(%)=处理组活性值/对照组活性值×100%。(6)细胞总抗氧化能力(T-AOC)的测定。细胞处理方法同SOD的测定，按相关试剂盒说明书操作进行。T-AOC(%)=处理组能力值/对照组能力值×100 %。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 清除DPPH自由基的作用

DPPH法是检测天然产物抗氧化活性常用的方法之一，当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519 nm处的吸光度A值随之减小[8]。根据该法测定得到样品和对照品的结果见表1，表1显示，大血藤各样品的DPPH·清除率随着质量浓度的升高而增加，其各部位清除DPPH自由基能力依次为：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位>石油醚部位。

表1 大血藤不同极性部位对DPPH·自由基清除能力Table 1 DPPH·scavenging effect of Sargentodoxa

2.2 还原Fe3+的作用

FRAP法根据样品吸光值的大小，对照FeSO4的标准曲线来计算出试样中对应的Fe2+的当量，从而得出药物的抗氧化活性的强弱[9]，大血藤醇提物各极性部位中，乙酸乙酯和正丁醇部分还原Fe3+的能力较强。见表2。

表2 大血藤不同极性部位对Fe3 +的还原能力Table 2 Fe3+ reduction ability of Sargentodoxa

2.3 清除ABTS自由基的作用

本实验采用K2S2O8与ABTS直接反应生成稳定的ABTS+·来测定样品的抗氧化能力。大血藤各极性部位的ABTS+·清除率随着质量浓度的升高而增加，抗氧化活性主要集中于乙酸乙酯和正丁醇部分。见表3。

2.4 成骨细胞的鉴定

显微镜下观察，细胞形态为单核，梭形，也可见多边形，细胞伸出较多突起；ALP为一种同源二聚体的糖蛋白，是成骨细胞早期分化的标志，成骨细胞经碱性磷酸酶染色后，细胞胞浆中呈黑色颗粒沉淀；矿化结节的形成包括胶原的沉积和基质的矿化两个步骤，是成骨细胞分化的最后阶段，成骨细胞经茜素红染色后，矿化结节呈橘红色。见图1。

表3 大血藤不同极性部位对ABTS+·的清除作用Table 3 ABTS+·scavenging effects of Sargentodoxa cuneata extract

2.5 大血藤各极性部位对成骨细胞的影响

利用MTT比色法测定不同浓度各极性部位对细胞增殖作用的影响，评价药物的毒性作用。实验结果如表4所示，不同浓度的各极性部位对细胞的增殖作用没有明显的影响，表明药物在所选浓度范围内没有细胞毒性。为了节约时间，因此在后续实验中，将选择0.8 mg/L、4 mg/L、20 mg/L作为作用浓度，且作用时间选择为24 h。

2.6 合适H2O2浓度筛选结果

分别利用800 μM/L、900 μM/L、1000 μM/L、1100 μM/L、1200 μM/LH2O2作用1 h，测定其对细胞活性的影响，如图2所示。1 mM/L H2O2作用1 h可以导致成骨细胞发生50%～60%比例的细胞损伤，因此选择该浓度作于后续研究。

图1 成骨细胞的鉴定。A：活体状态观察(100×)；B：碱性磷酸酶染色(100×)；C：碱性磷酸酶染色(400×)；D：茜素红染色(40×)；E：茜素红染色(100×)Fig.1 Identification of osteoblasts. A: cell morphological observation (100×); B: ALP staining (100×); C: ALP staining (400×); D: Alizarin red staining (40×); E: Alizarin red staining (100×)

表4 大血藤不同极性部位对成骨细胞的影响Table 4 The effect of Sargentodoxa cuneata extract on osteoblasts n=3)

2.7 大血藤各极性部位对成骨细胞氧化损伤的保护作用

同对照组相比，单纯H2O2作用可以导致活性细胞数量降低，给予大血藤不同极性部位预处理后，活性细胞数量以药物浓度依赖的方式增加，其中乙酸乙酯部位(0.8 mg/L、4 mg/L、20 mg/L)作用后，改善活性细胞数量作用最佳，与对照组相比，存活率由未加大血藤保护的H2O2模型组的(49.36±0.27)%分别上升至(60.27±0.32)%、(64.27±0.45)%、(69.47±0.27)%。其次为正丁醇部位，存活率分别为(61.15±0.35)%、(62.61±0.32)%、(64.97±0.58)%。石油醚部位作用最弱，但与模型组对比，仍具有一定的作用，存活率随着浓度的增大而上升，分别为(49.43 ±0.70)%、(52.27±0.27)%、(57.61±0.64)%。表明大血藤各个极性部位均对氧化应激导致的成骨细胞凋亡具有一定的预防作用。见图3。

2.8 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定结果

超氧化物歧化酶对机体的抗氧化能力起着至关重要的作用，此酶通过清除超氧阴离子自由基来保护细胞免受损伤。H2O2损伤后，细胞内SOD活力有所下降，比对照组降低了51.60%，而大血藤不同极性部位不同剂量组作用后，均能提高细胞内SOD的活力，并且呈一定的浓度依耐性。与模型组相比，大血藤各极性部位高浓度处理组细胞内的SOD分别升高了117.96%、207.35%、159.65%和147.98%，中浓度处理组分别升高了77.89%、180.28%、122.33%和133.77%，低浓度处理组分别升高了55.15%、146.99%、85.76%和123.55%。见图4。

图2 不同浓度的H2O2对成骨细胞的影响Fig.2 The effect of the different concentration of H2O2 on osteoblasts

图3 大血藤各极性部位对H2O2氧化损伤的预防作用Fig.3 The protective effect of Sargentodoxa cuneata extraction on osteoblasts n=4)注：与模型组比较，**P<0.01，* P<0.05。

图4 大血藤各极性部位SOD活性测定结果 Fig.4 Results of SOD activity of Sargentodoxa cuneata extracts n=3)注：与模型组比较，**P<0.01，* P<0.05。

2.9 细胞总抗氧化能力(T-AOC)的测定结果

通过测定细胞总抗氧化能力(T-AOC) 的大小，验证大血藤是否能提高成骨细胞的整体抗氧化能力，从而达到骨保护的作用。抗氧化能力模型组的总抗氧化能力与对照组相比，降低了37.03%。大血藤不同极性部位不同剂量组与对照组对比，均能提高细胞的总抗氧化能力，其中乙酸乙酯部位抗氧化能力作用最佳，且呈浓度依耐性关系，随着浓度的增大，抗氧化能力逐渐增强，分别为(164.32±2.96)%、(201.50±6.66)%、(221.51±7.24)%，石油醚部位抗氧化能力最弱，分别为(110.00±2.30)%、(127.99±4.39)%、(153.08±3.58)%。见图5。

图5 大血藤各极性部位T-AOC活性测定结果Fig.5 Results of T-AOC activity of Sargentodoxa cuneata extracts n=3)注：与模型组比较，**P<0.01，* P<0.05。

3 讨论

大量研究证实氧化应激与骨质疏松症存在密切的联系。当机体处于氧化应激状态时，机体内会产生过多的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，超出了其清除能力，导致内源性的抗氧化剂，如维生素 C、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的量相对不足。另外，国外研究曾报道，氧化应激导致成骨细胞凋亡，减少成骨细胞数量[10]。而抗氧化剂可以改善体内的氧化应激状态，达到改善骨质疏松症状的目的[11]。因此在此次实验中，先测定大血藤各个极性部位的体外抗氧化能力，再直接作用于过氧化氢诱导的成骨细胞，通过比较氧化应激状态下成骨细胞的存活情况，分析可能存在的作用机制。实验证明，大血藤可能通过增强细胞内的SOD、CAT和GSH-Px等酶的活力，来保护MC3T3-E1Subclone 14细胞免受H2O2诱发的氧化损伤。

本实验以体外DPPH、FRAP和ABTS法为评价方法，以抗坏血酸作为参照物，研究大血藤不同极性部位的抗氧化活性。研究表明，乙酸乙酯部位在清除DPPH自由基活性实验，还原Fe3+能力测定中活性以及清除ABTS+·自由基活性实验中活性最强，正丁醇部位和水部位稍低，石油醚部位抗氧化活性最低，且就同一实验组来看，抗氧化能力与浓度成一定线性关系，浓度越高，活性越强。

目前，关于大血藤对氧化应激后成骨细胞的影响的研究还未见报道。H2O2是最常见的活性氧自由基，易穿透细胞膜，通过攻击细胞增殖期DNA及合成DNA所需的酶，导致细胞死亡和凋亡[12]。因此在此次实验中，笔者选用H2O2直接作用于成骨细胞来制造氧化应激模型，并且观察到经H2O2处理后细胞活性变差，部分细胞伪足收缩，且有无细胞的空白区域。但利用大血藤处理后，不同极性部位处理组的细胞活性均有不同程度地改善，且乙酸乙酯部位效果较佳，这与其抗氧化活性相吻合，推测乙酸乙酯部位中可能存在某种强抗氧化剂可与成骨细胞内的活性氧作用，抑制氧化损伤，刺激细胞增殖，来达到骨保护的目的。

另外，实验结果证实，H2O2损伤组细胞内的SOD和T-AOC与对照组相比，都有所下降，说明H2O2处理细胞后，降低了细胞的抗氧化能力，导致细胞内自由基的增多，从而抑制了成骨细胞的增殖。而大血藤乙酸乙酯部位预保护成骨细胞24 h后，可以明显地增强细胞内的SOD的活力及提高细胞的总抗氧化能力。总之，大血藤不同极性部位的体外抗氧化活性及对过氧化氢诱导成骨细胞氧化损伤的保护作用效果基本一致，均以乙酸乙酯部位作用最佳，这些结果提示，大血藤乙酸乙酯部位可能是通过增强细胞清除自由基的能力来保护成骨细胞免受H2O2诱发的氧化损伤。

大血藤的抗氧化活性主要与其所含的酚类有密切关系，而多酚类化合物在细胞系和动物实验中已经被证实具有良好的抗骨质疏松作用[13]。因此笔者将结合前期的研究结果，进一步考察大血藤乙酸乙酯部位，从中寻找到一种有效的酚类化合物，以期为骨质疏松新药的开发提供理论和实验依据。