李应福 李宁* 谢兴文 宋敏 徐世红 蒋国鹏

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2. 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

近年来，随着人们生活节奏的加快，骨折的发生率大大提高，继之骨折后骨缺损的发生逐年呈现增高趋势，如何使这种高能量、高速度、多复合伤损伤的愈合时间与愈合速度及治愈率显著提升，减少愈合延迟、畸形愈合及不愈合的发生几率，已经成为骨科领域一项长期面临的挑战与机遇[1-4]。目前大量研究表明，从分子生物学、细胞生物学及基因水平入手，通过中药血清药理学结合现代化检测方法，研究单味中药或中药复方治疗疾病的靶点与作用机制，充分将传统中医药与西药治疗相结合，这将成为理论上更具有科学性、有效性、安全性的新思路[5-6]。在前期研究的探讨、分析与总结基础上，本研究主要观察SCF、MCP-1 mRNA在颅骨骨缺损模型大鼠中的作用及通过麝香干预后对SCF、MCP-1 mRNA的表达影响，探讨麝香对骨缺损修复及愈合的重要作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：300只SD大鼠，雌性150只，雄性150只，体质量(200±20)g，均由甘肃中医药大学SPF实验动物中心提供，动物设施使用证明No：00000230；动物质量合格证No：62001000000201。

1.1.2药物、试剂、设备：麝香购于甘肃兰州安泰堂天顺行药业，由甘肃中医药大学中药鉴定学教研室鉴定，为天然麝香。氯胺酮注射剂(西安力邦制药有限公司)。SCF酶联免疫试剂盒(Rat SCF ELISA KIT，上海酶联生物科技有限公司，货号：m1002853)；酶联免疫检测仪(型号RT-6100，深圳雷杜生命科学股份有限公司)；Trizol Reagent(invitrogen公司)；RNA的逆转录试剂盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，promega公司)、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(toyobo公司)；Agilent Technologies(SureCycler 8800)；PRO 200型组织匀浆器(上海季诺科贸有限公司)；颅骨钻(南韩STRONG 90)；CT14RD台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备有限公司)；Q5000微量紫外分析仪(美国Quawell公司)；7500型PCR热循环仪(美国ABI公司)。

1.2方法

1.2.1颅骨骨缺损模型的建立：严格以氯胺酮0.1 g/kg体重腹腔注射大鼠，2～4 min后取俯卧位，利用自制固定板固定大鼠头部及四肢，头部术野处湿毛、剪毛、碘伏消毒，然后剪长约1～1.5 cm纵行切口，除去局部骨膜充分暴露颅骨。用直径5 mm钻头的颅骨钻在术野处造成直径约5 mm的圆形骨缺损，以不损伤头部毛细血管及硬脑膜为原则，用无菌生理盐水冲洗骨缺损区域，去除残存骨屑，然后逐层缝合，缝完皮肤层后用碘伏消毒伤口[7]。

1.2.2分组与给药：所有模型大鼠称重，按体重编号，采用完全随机法分为给药组与模型组，每组各150只，然后再将这两组通过完全随机法分别分为3小组，每组50只。给药组灌服麝香，以4.2 mg/100 g为计算标准，灌胃剂量按人与大鼠体重的折算公式计算，麝香通过研钵将其充分研磨后溶于折算后蒸馏水中反复吹打，模型组灌服等体积的生理盐水，两组均每日灌服一次，分别持续灌服7 d、14 d、28 d。

1.2.3检测标本制备：对所有模型大鼠持续灌胃7 d时，分别对给药组(第1组)、模型组(第4组)大鼠进行股动脉采血及颅骨骨缺损处取材；持续灌胃14 d时，分别对给药组(第2组)、模型组(第5组)大鼠进行股动脉采血及颅骨骨缺损处取材；持续灌胃28 d时，分别对给药组(第3组)、模型组(第6组)大鼠进行股动脉采血及颅骨骨缺损处取材；将每次取出的血液3 000 r/min离心10～15 min，取上清，放置-20℃冰箱备用。将每次制备的颅骨骨缺损样本标号、液氮冷冻、放入冷冻管，放置-80 ℃冰箱备用。

1.2.4SCF含量测定：参照Jian1等[8]的方法，按照SCF试剂盒检测说明书操作，实验结果以酶标仪读数为准。具体步骤：稀释标准品→加样品及标准品→加酶→显色液A、B→加入终止液→15 min内450 nm波长测OD值。根据OD值和标准物浓度绘制标准曲线，将OD值代入相应公式计算最终浓度。

1.2.5MCP-1 mRNA含量测定：参照 Xu等[9]的方法：①按照Trizol法提取组织总RNA说明书操作，取100 mg骨缺损组织加入1 ml Trizol，用小剪刀将其剪碎，利用匀浆器将骨组织充分匀浆，依照提取步骤提取骨缺损组织总RNA，通过微量紫外分析仪检测总RNA浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。②各组取16 ul总RNA联合promega RNA逆转录试剂盒其他试剂形成40 ul体系逆转录为cDNA。③以完成逆转cDNA为模板按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix说明书操作加入相关试剂及引物最终成20 ul体积进行PCR扩增。引物序列如表1，具体反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，61 ℃退火30 s，95 ℃退火15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。以7500型PCR热循环仪分析软件，将相对定量值RQ及处理后CT值用于统计分析。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

图1 肉眼观察颅骨骨缺损模型Fig.1 Macroscopic observation of the skull bone defect model

图2 颅骨骨缺损处取材样本Fig.2 Sample collection from the skull bone defect

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 造模完成后肉眼观察大鼠颅骨有一5 mm左右的圆形骨缺损(图1)

2.2 颅骨骨缺损取材(图2)

2.3 麝香对两组颅骨骨缺损模型大鼠不同时间段内血清中SCF表达的影响

结果显示，随着时间的延长，模型组SCF表达水平呈递增趋势，与模型组比较，给药组第7天SCF含量表达最高，且两组间差异有显著统计学意义(P<0.01)；给药组第14天SCF表达水平较之前降低，与模型组比较差异无统计学意义；第28天SCF表达水平又有所增高，且与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。给药组不同时间段各组内比较差异均无统计学意义。这提示在麝香的干预下，可能主要通过上调SCF表达水平来促使骨缺损区域的修复愈合，与模型组比较，第7天和第28天其表达均增高，但第7天表达更加显著。见表2。

表2 大鼠骨缺损模型血清中SCF表达Table 2 Expression of serum SCF in rat bone defect model

注：与模型组比较，*P<0.01。

2.4 麝香对两组颅骨骨缺损模型大鼠不同时间段内颅骨骨缺损处MCP-1 mRNA表达的影响

与模型组比较，MCP-1 mRNA在第7天表达最高，且差异有统计学意义(P=0.0046)，第7天之后持续降低，第28天接近于模型组，给药组第14天与第28天与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，给药组各时间段比较显示，第7天和第28天比较差异有显著性统计学意义(P=0.001)。说明通过对颅骨骨缺损模型大鼠不同时间段灌服麝香后，MCP-1 mRNA可能在第7天出现高表达有助于缺损区的修复，缩短愈合时间。见表3。

表3 大鼠骨缺损模型骨缺损组织中MCP-1 mRNA表达水平Table 3 Expression of mRNA MCP-1 in bone defect of rat bone defect model

注：与模型组比较，*P<0.01。

MCP-1扩增曲线前期曲线基线平整，低浓度样本指数期明显，各反应管的扩增效率相近，为较理想的扩增曲线，见图3。图4显示其溶解曲线呈单峰，说明扩增产物较纯且单一，为较理想的溶解曲线。

图3 MCP-1扩增曲线Fig.3 MCP-1 amplification curve

图4 MCP-1溶解曲线Fig.4 MCP-1 dissolution curve

3 讨论

骨折后骨缺损疾病在临床上越来越多见，经过长期的临床观察及治疗效果，发现治疗方式的多种多样(自体骨、异体骨、组织工程骨、人工骨修复材料等)，其治疗效果均有一定程度的局限性。为了在这方面有所突破，寻求一个快速、安全、高效、低损伤的治疗方法，探索其作用途径及效果显得尤为重要。麝香是鹿科动物成熟雄体(马麝、原麝等)香囊中的干燥分泌物。其味辛性温，归心、脾、肝经，具有开窍醒神、活血通络、散结止痛等功效，《本草纲目》记载：它有“通诸窍，开经络，透肌骨”等功效。其性辛香走窜，脏腑筋骨、肌肤孔窍无所不达，麝香的用途十分广泛，主要作用于温热病邪陷心包痰厥、猝然倒仆、气郁暴厥、牙关紧闭及症瘕积聚、跌打损伤等证。目前已有大量实验证实，在骨折修复愈合微环境过程的不同时期确实存在具有诱导成骨作用的多种生长因子与细胞因子参与、调节的。传统接骨方药中频繁的使用麝香治疗跌打损伤、骨折等疾病，说明麝香具有引药物直达病所的作用，但到底是哪些存在于骨细胞中的骨生长因子，并且是通过哪种途径在特定的微环境中进行调节，从而促进机体自我修复能力，这是本实验研究的主要内容。研究发现[10]低浓度麝香可以促使大鼠颅骨骨缺损处基质细胞衍生因子1的表达增加，促进大鼠颅骨骨缺损处骨痂形成，缩短愈合时间。本实验主要探索麝香促使骨缺损修复愈合的机制可能与SCF、MCP-1有关。

SCF在维持造血细胞存活，促使成体干细胞增殖与分化的过程中起重要作用，不仅促进干细胞分裂，且抑制细胞凋亡[11]。SCF生物学活性的发挥主要通过与其受体c-kit结合实现，SCF在骨缺损区或骨折区通过促进骨髓基质干细胞的大量募集是骨修复与骨愈合的细胞学基础及微环境条件下重要的前提条件。徐丽等[12]利用SD大鼠建立下颌骨缺损，采用免疫组织化学法及免疫印迹法检测骨缺损区不同时间点SCF含量的表达情况，结果发现两种检测方法在骨缺损修复过程中SCF表达比正常组织中明显增高，且与时间均呈负相关，这说明SCF在骨缺损修复过程中与促使骨髓基质干细胞分化为成骨细胞、成纤维细胞等密切相关，是一种重要的趋化因子。而本研究结果中发现SCF第7天表达最高，随后呈现降低趋势，这表明骨缺损在不同时期其表达作用将有所变化，这可能与骨折愈合分期存在密切关系。MCP-1作为一种对单核细胞有趋化作用的重要调控因子，具有广泛的生物学效应，主要通过调节单核巨噬细胞的聚集或疏散而起作用，参与炎症反应的迁移与黏附、释放与聚集、清除致炎物质和组织修复等。因此，MCP-1不仅对骨骼的修复与重塑有重要作用，在肾病、免疫缺陷性疾病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病中也扮演着重要角色[13]。相关研究表明，阻断MCP-1 表达可明显减缓缺血性心肌病的发展[14]；郑力峰等[15]通过对48例腰椎间盘突出症患者检测髓核组织中MCP-1 mRNA表达含量，发现由于明显的炎性细胞浸润及炎性反应的出现，可分泌大量的细胞因子，同时使MCP-1 mRNA表达上调，这说明MCP-1会随患者疼痛症状的变化而发生异常[16]，其机理与本研究基本相符，MCP-1的主要功能是趋化和激活单核细胞至炎性反应部位，骨折前期释放大量炎性因子发生炎性反应，灌服麝香可以使MCP-1向骨缺损区大量聚集并激活微环境中相关信号通路或调节因子而发挥促愈合作用，后期随着其炎性反应相应减少MCP-1 mRNA表达也就降低。另外有研究报道，MCP-1在正常骨组织中不表达，但在出现骨骼相关炎症反应过程中会出现非持续性的MCP-1上调，其炎性反应程度越重MCP-1 上调越高，例如恶性原发性骨肿瘤和转移性骨肿瘤组织中MCP-1的表达均明显高于良性骨肿瘤[17-18]。这可能与激活相关细胞因子并调节成骨-破骨系统之间的失衡状态，进而促使骨骼的修复与重塑有关[19]。

本实验研究结果表明SCF、MCP-1可能参与骨缺损修复与重建的整个过程，这对促使骨折后骨缺损愈合，缩短愈合时间等方面提供了新的思路，对探索中药在中医理论的指导下参与疾病的修复及治疗方面有重要意义。但尚存在一些仍需要继续研究探索的问题，例如SCF、MCP-1趋化因子是通过哪种信号转导通路起修复作用；虽然得出促使骨缺损修复的机制可能与增加SCF、MCP-1mRNA有关，但其修复效果的最佳时间点仍需要大样本、多层次的基础研究；是否存在具有相同作用或更好疗效的其他因子以及表达量不同的具体作用机制，这些问题的解决才能进一步为临床治疗骨缺损疾病提供有力的依据。