苏 平 刘 芸 宋思圆 喻良仁

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院， 杭州 310058)

共轭亚油酸-精氨酸的制备及其抗氧化活性研究

苏 平 刘 芸 宋思圆 喻良仁

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院， 杭州 310058)

等摩尔的共轭亚油酸(CLA)和精氨酸(Arg)通过溶解、混合、浓缩和冷冻干燥等步骤制得水溶性的共轭亚油酸-精氨酸(CLA-Arg)复合物，探究了CLA-Arg复合物对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和对卵黄脂蛋白过氧化的抑制作用，并通过Rancimat法测定不同抗氧化剂对大豆油氧化诱导时间的影响。结果表明：CLA-Arg复合物对DPPH自由基(IC502.76 mg/mL)和ABTS自由基(IC501.43 mg/mL)均有良好的清除效果；在浓度为1.0 mg/mL时，其对卵黄脂蛋白过氧化体系的抑制率达到41.8%；在添加量为0.1%时，使得氧化诱导时间延长到1.79 h且高于BHT，从而CLA-Arg具有良好的抗氧化活性。

水溶性 共轭亚油酸-精氨酸 自由基 抗氧化活性

黄秋葵又名秋葵、补肾草、洋辣椒等，属锦葵科秋葵属一年生草本植物，种子中富含多种脂肪酸，如亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸等，丰富的亚油酸可以转化形成具有多种功能活性的共轭亚油酸。共轭亚油酸是含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸，与亚油酸形成位置和构象上的异构体，具有生物学活性的2种异构体为9c，11t-CLA和10t，12c-CLA。大量人体及动物学试验表明，CLA具有降脂[1]、抗氧化[2]、抗癌[3]、提高免疫力、抗动脉粥样硬化[4]、增加肌肉等生理活性，被誉为“21世纪的新型营养素”。

CLA作为一种功能性因子，因其水不溶性在食品行业的应用受到极大限制，因此提高其水溶性和稳定性具有重要的实践意义[5]。精氨酸是一种水溶性氨基酸，作为NO的前体，在治疗心血管疾病以及免疫调节方面发挥重要作用，同时精氨酸是婴幼儿的必需氨基酸，作为一种营养增补剂在营养代谢与调控中发挥积极作用[6-7]。因此，将共轭亚油酸与精氨酸结合形成水溶性复合盐，稳定性得到加强的同时既能够增加精氨酸的摄入又能够拓宽CLA在食品及医药领域的应用。本研究以等摩尔的CLA和Arg通过溶解、混合、浓缩和冻干等步骤制得水溶性CLA-Arg复合盐，并通过4种体系探究了其抗氧化活性，分别为对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和对卵黄脂蛋白过氧化的抑制作用以及通过Rancimat法测定不同抗氧化剂对大豆油氧化诱导时间的影响，旨在为CLA-Arg的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

共轭亚油酸(来自黄秋葵籽，纯度75%)；大豆油：市售；精氨酸、BHT、DPPH、ABTS、卵黄脂蛋白、硫代巴比妥酸：阿拉丁试剂有限公司；无水乙醇、醋酸钠、醋酸、过二硫酸钾、三氯乙酸、硫酸亚铁、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津有限公司；TGL20M台式高速冷冻离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；743 Rancimat油脂氧化稳定性测量仪：瑞士Metrohm公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黄秋葵种子中共轭亚油酸的制备

以黄秋葵种子为原料，石油醚为浸提剂，置于超声波清洗器中反应30 min，抽滤除去滤渣，将混合油置于旋转蒸发器中回收石油醚，收集母液即得到黄秋葵籽油。后以籽油为原料，KOH为催化剂，丙二醇为溶剂，于180 ℃的油浴锅内反应3 h，籽油中的亚油酸成功转化为共轭亚油酸，采用尿素包合法纯化不饱和脂肪酸，经测定共轭亚油酸纯度达到75%。

1.3.2 共轭亚油酸-精氨酸复合物的制备

参照Kim等[8]方法，适当修改。取10 g精氨酸溶解于60 mL蒸馏水中，16 g共轭亚油酸溶解于100 mL 95%乙醇中，将共轭亚油酸溶液以100 g/min的速率加入到精氨酸溶液中，同时置于磁力搅拌器上搅拌直至混合溶液变得澄清透明。将得到的透明液体于45 ℃旋转蒸发，除去乙醇，余下水溶液于冻干机中冷冻干燥，即得共轭亚油酸-精氨酸复合物粉末。

1.3.3 DPPH自由基的清除能力

参考Lai等[9]方法，略有修改。准确称取9.85 mg DPPH用无水乙醇定容到250 mL，获得0.1 mmol/L的DPPH溶液于4 ℃冰箱中避光保存备用。分别取0.5 mL不同浓度的样品与4.5 mL DPPH溶液于10 mL试管中振荡摇匀，常温避光反应60 min后在517 nm处测定吸光值，每个样品测定3次，按照下式计算清除率。

式中：A0为DPPH溶液+无水乙醇的吸光值；A1为DPPH溶液+样品稀释液的吸光值；A2为无水乙醇+样品稀释液的吸光值。

1.3.4 ABTS自由基的清除能力

参考Arnao等[10]方法，略有修改。用pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液配制7 mmol/L的ABTS储备液，ABTS储备液和2.45 mmol/L的过二硫酸钾等体积反应产生ABTS+，此溶液需在室温黑暗处放置12～16 h后使用。稳定后的ATBS+溶液用无水乙醇稀释，使其在734 nm处的吸光值为0.70±0.02，取4.9 mL该溶液与0.1 mL样品稀释液充分混匀后，避光放置5 min，在734 nm处测定吸光值，每个样品测定3次，按照公式计算清除率。

式中：A0为ATBS+溶液+无水乙醇的吸光值；A1为ATBS+溶液+样品稀释液的吸光值；A2为无水乙醇+样品稀释液的吸光值。

1.3.5 卵黄脂蛋白过氧化的抑制能力

参考张尔贤等[11]方法，略有修改。用0.1 mol/L pH为7.4的磷酸盐缓冲液配制体积分数3.85%的卵黄悬浮液，0.4 mL的卵黄悬浮液分别与0.1 mL不同浓度的样品稀释液反应，同时以CLA、Arg、BHT为阳性对照，无水乙醇为空白对照，再加入0.4 mL浓度为25 mmol/L的硫酸亚铁，用1.0 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液补充至4 mL，37 ℃恒温振荡15 min，取出后分别加入1 mL质量分数20%的三氯乙酸，吸取上清液4 mL于试管中，加入质量分数0.28%硫代巴比妥酸溶液2 mL，加塞，沸水浴15 min，冷却后于波长532 nm处测定吸光值，每个样品测定3次，按照公式计算抑制率。

式中：A0为空白对照组的吸光值；A1为样品组的吸光值。

1.3.6 Rancimat法对氧化诱导时间的影响

参考Cordeiro等[12]方法，略有修改。准确称取大豆油3.00 g置于样品管中，分别加入不同浓度的样品稀释液，以CLA、Arg、BHT为阳性对照，乙醇为空白对照，油脂氧化稳定性测定仪恒定温度为131 ℃，空气流速为20 L/h，测定不同组的氧化诱导时间，时间越长，说明氧化稳定性越好。

1.3.7 数据处理

采用Microsoft Excel软件对数据进行整理，Origin 8.5 软件作图以及SPSS 19.0 软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基的清除能力

DPPH在乙醇溶液中形成一种稳定的自由基，呈现深紫色，在517 nm处有特征吸收。当有抗氧化剂存在时，其提供的氢原子与DPPH自由基的孤对电子配对，生成无色物质，从而吸光值降低[9，13]。由图1可知，相同浓度下，CLA-Arg对DPPH自由基的清除率明显高于Arg，同时CLA对DPPH自由基的清除作用较弱[2]，表明Arg和CLA存在协同抗氧化作用，使得Arg-CLA的抗氧化活性得到增强。在一定浓度范围内，BHT、CLA-Arg和Arg对DPPH自由基的抑制率与浓度成正相关，BHT对DPPH自由基的抑制率明显高于CLA-Arg和Arg，其中BHT的IC50值为0.201 mg/mL，CLA-Arg的IC50值为2.76mg/mL，CLA-Arg对DPPH自由基的抗氧化效果约为BHT的十分之一，具有较好的DPPH自由基清除能力。

图1 不同浓度CLA-Arg、Arg、BHT对DPPH自由基的清除

2.2 ABTS自由基的清除能力

ABTS自由基能够与抗氧化剂提供的电子迅速反应，使其稳定的蓝绿色发生褪色，此变化可用734 nm 处吸光度的变化来评价。由于ABTS自由基能够同时与亲水性或亲脂性抗氧化剂反应，并且其pH值的适用范围较广，因此ATBS法作为一种简单、快速、可靠的抗氧化评价方法得到广泛应用[14]。由图2可知，在一定浓度范围内，BHT、CLA-Arg和Arg对ABTS自由基的抑制率与浓度成正相关，BHT对ABTS自由基的抑制率明显高于CLA-Arg和Arg，CLA-Arg对ABTS自由基的抑制率略高于Arg，其中BHT的IC50值为0.102 mg/mL，CLA-Arg的IC50值为1.43 mg/mL，表明CLA-Arg对ABTS自由基的抗氧化效果约为BHT的十分之一，具有良好的ABTS自由基清除能力。由图1和图2可知，CLA-Arg清除DPPH自由基的IC50值为2.76 mg/mL，清除ABTS自由基的IC50值为1.43 mg/mL，说明CLA-Arg对ABTS自由基的清除能力高于DPPH，这主要是由于ABTS自由基能够溶于水相和有机相，而DPPH自由基只能够溶于有机相，所以ABTS自由基的敏感性要比DPPH强。

图2 不同浓度CLA-Arg、Arg、BHT对ABTS自由基的清除

2.3 卵黄脂蛋白过氧化的抑制能力

卵黄脂蛋白富含多不饱和脂肪酸，在Fe2+的催化下可以引起脂质过氧化反应，据报道很多疾病和细胞衰老现象都与细胞膜上的脂质过氧化有关。本试验以卵黄脂蛋白溶液为脂质过氧化体系，通过测定吸光度的变化来评价各抗氧化剂对脂质过氧化的抑制能力。由图3可知，CLA-Arg在0.2～1.0mg/mL范围内，对卵黄脂蛋白的过氧化抑制率随浓度的增加而增大；在0.2 mg/mL下，CLA-Arg对过氧化体系的抑制率高于单独的CLA和Arg，显著低于人工合成抗氧化剂BHT，但在1.0 mg/mL时，CLA-Arg对过氧化体系的抑制率达到41.8%，约为BHT抑制率的一半，可见高浓度的CLA-Arg对Fe2+诱发的卵黄脂蛋白过氧化体系有较好的抑制效果。

注：1为0.2 mg/mL CLA-Arg，2为0.4 mg/mL CLA-Arg，3为0.6 mg/mL CLA-Arg，4为0.8 mg/mL CLA-Arg，5为1.0 mg/mL CLA-Arg，6为0.2 mg/mL CLA，7为0.2 mg/mL Arg，8为0.2 mg/mL BHT。图3 不同抗氧化剂对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制效果

2.4 Rancimat法对氧化诱导时间的影响

油脂样品在恒定温度下通入干燥空气，不饱和脂肪酸会被氧化成小分子易挥发的酸，进而被空气带入盛有蒸馏水的电导率测量管中，监测并记录电导率对反应时间的氧化曲线，从而得到样品的氧化诱导时间。抗氧化剂的加入可以延缓油脂氧化酸败，延长诱导时间[15]。由图4可知，加入不同抗氧化剂组的氧化诱导时间均比空白组长，在CLA-Arg的添加量从0.04%增加到0.10%的过程中，油脂氧化诱导时间随添加量的增大而增加。当添加量为0.04%时，CLA-Arg组的氧化诱导时间长于单独的CLA和Arg组，表明Arg和CLA存在协同抗氧化作用；当CLA-Arg添加量为0.1%时，其氧化诱导时间延长到1.79 h，远高于0.02%BHT添加组，低于0.02%TBHQ添加组，表明CLA-Arg的加入能够一定程度上延缓油脂氧化，延长诱导时间。

注：1为空白，2为0.04% CLA-Arg，3为0.06% CLA-Arg，4为0.08% CLA-Arg，5为0.10% CLA-Arg，6为0.04% CLA，7为0.04% Arg，8为0.02% BHT，9为0.02% TBHQ。图4 不同抗氧化剂对大豆油的抗氧化效果

3 结论

结果表明，CLA-Arg对DPPH、ABTS自由基的清除以及脂质过氧化的抑制和氧化诱导时间的影响均随着浓度的增大其效果增强，CLA-Arg对DPPH、ABTS自由基的清除能力约为BHT清除能力的十分之一；当CLA-Arg为1.0 mg/mL时，其对脂质过氧化体系的抑制率达到41.8%，约为0.2 mg/mL BHT抑制率的一半；CLA-Arg添加量为0.1%时，其延缓油脂氧化的能力要高于0.02%BHT添加组，但低于0.02%TBHQ添加组。CLA-Arg 的抗氧化能力明显高于单独的Arg和CLA，这说明Arg和CLA对CLA-Arg复合物的抗氧化性具有协同促进的作用，很可能的一个原因就是CLA羧基端Arg的存在能够有效地保护氧化攻击，同时精氨酸的亲水基团增强了亲水体系中CLA的抗氧化性。

水溶性CLA-Arg复合物能够极大地拓宽其在保健食品以及医药等领域中的应用范围，并在一定程度上通过清除自由基、抑制脂质过氧化以及延缓油脂的氧化等多种途径发挥其抗氧化活性，是一种潜在的抗氧化剂资源。

[1]Hur S J, Kim D H, Chun S C, et al. Effects of dietary conjugated linoleic acid and biopolymer encapsulation on lipid metabolism in mice[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(4): 6848-6862

[2]Kim Y J, Lee K W, Lee H J. Total antioxidant capacity of arginine-conjugated linoleic acid (CLA) complex[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(3): 439-444

[3]El R A, Bard J M, Huvelin J M, et al. The anti-proliferative and pro-apoptotic effects of the trans9, trans11 conjugated linoleic acid isomer on MCF-7 breast cancer cells are associated with LXR activation[J]. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 2013, 88(4): 265-272

[4]Chinnadurai K, Kanwa H K, Tyagi A K, et al. High conjugated linoleic acid enriched ghee (clarified butter) increases the antioxidant and antiatherogenic potency in female Wistar rats[J]. Lipids in Health and Disease, 2013, 12(1): 121

[5]Wu G Y, Bazer F W, Davis T A, et al. Arginine metabolism and nutrition in growth, health and disease[J]. Amino Acids, 2009, 37(1): 153-168

[6]常情情,周星,许艳,等.直链糊精-共轭亚油酸复合物的制备及理化性质分析[J]. 现代食品科技,2014,30(8):151-156 Chang Q Q, Zhou X, Xu Y, et al. Preparation and physicochemical properties of an amylose-conjugated linoleic acid complex[J]. Modern Food Science and Technology, 2014, 30(8):151-156

[7]Pernow J, Jung C. Arginase as a potential target in the treatment of cardiovascular disease: Reversal arginines steal[J].Cardiovascular Research, 2013,98(3):334-343

[8]Kim Y J, Lee K W, Lee S, et al. The production of high-purity conjugated linoleic acid (CLA) using two-step urea-inclusion crystallization and hydrophilic arginine-CLA complex[J]. Food Chemistry and Toxicology, 2003, 68(6):1948-1951

[9]Lai P, Li K Y, Lu S, et al. Phytochemicals and antioxidant properties of solvent extracts from Japonica rice bran[J]. Food Chemistry, 2009, 117(3):538-544

[10]Arnao M B, Cano A, Acosta M. The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity[J]. Food Chemistry, 2001, 73(2):239-244

[11]张尔贤,方黎,张捷,等.菊花提取物的抗氧化活性研究[J].食品科学,2000,21(7):6-9 Zhang E X, Fang L, Zhang J, et al. Study on theantioxidant activity of chrysanthemum extract[J]. Food Science, 2000, 21(7):6-9

[12]Cordeiro A M T M, Medeiros M L, Silva M A A D, et al. Rancimat and PDSC accelerated techniques for evaluation of oxidative stability of soybean oil with plant extracts[J]. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2013, 114(2):827-832

[13]张玉锋,段岢君,王威,等.脱脂椰子种皮多肽的抗氧化活性研究[J].中国粮油学报,2014,29(8):65-68 Zhang Y F, Duan K J, Wang W, et al.Antioxidant activities of De-Fat coconut endocarp peptide[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2014, 29(8):65-68[14]Dawidowicz A L, Olszowy M. The importance of solvent type in estimating antioxidant properties of phenolic compounds by ABTS assay[J]. European Food Research and Technology, 2013, 236(6):1099-1105

[15]Farhoosh R. The effect of operational parameters of the Rancimat method on the determination of the oxidative stability measures and shelf-life prediction of soybean oil[J]. Journal of the American Oil Chemists Society, 2007, 84(3):205-209.

Preparation and Antioxidant Activity of Conjugated Linoleic Acid-Arginine Complex

Su Ping Liu Yun Song Siyuan Yu Liangren

(College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058)

Water-soluble conjugated linoleic acid-arginine (CLA-Arg) complex had been prepared by dissolving, mixing, concentration and freeze drying from same mole of CLA and Arg. The antioxidant activity of CLA-Arg was studied by measuring its scavenging effects on DPPH radical and ABTS radical, inhibition effect on liposome peroxide and influence on oxidation induction time by Rancimat. The results showed that CLA-Arg had strong scavenging capacity on DPPH radical (IC502.76 mg/mL) and ABTS radical (IC501.43 mg/mL); the inhibition rate of liposome peroxide system was 41.8% when the concentration was 1.0 mg/mL; the oxidation induction time extended to 1.79 h and was higher than BHT when the content was 0.1%. CLA-Arg had a significant antioxidant activity.

water-soluble, conjugated linoleic acid-arginine (CLA-Arg), free radical, antioxidant activity

2015-10-28

苏平，男，1962年出生，副教授，果蔬加工

刘芸，女，1989年出生，硕士，食品科学与工程

TS229

A

1003-0174(2017)06-0074-05