陈中伟 王可可 刘艳霞 徐 斌

(江苏大学食品与生物工程学院；农产品加工工程研究院，镇江 212013)

无机盐对小麦胚芽脂肪酶结构和活性的影响

陈中伟 王可可 刘艳霞 徐 斌

(江苏大学食品与生物工程学院；农产品加工工程研究院，镇江 212013)

为探索一种新型的小麦胚芽稳定化方法，采用圆二色谱和荧光光谱对无机盐处理后的商品化麦胚脂肪酶的结构进行了研究，同时，考察了不同无机盐对麦胚中脂肪酶活力及麦胚酸价的影响。结果表明，当NaCl浓度为4×10-9mol/L时，对商品化麦胚脂肪酶的抑制效果最好，其活力降低了21.8%，而KCl对脂肪酶的活力无显著影响，CaCl2和MgCl2均对脂肪酶有激活作用；所选无机盐对脂肪酶二级结构均无明显影响，但NaCl对脂肪酶的三级结构有一定影响；当添加无机盐后，麦胚中的脂肪酶活力和麦胚的酸价均低于未添加无机盐的麦胚，其中1.30%NaCl使脂肪酶活力降低了62.49%，0.75% KCl使脂肪酶活力降低了61.27%。由以上结果可知，添加无机盐可作为有效抑制脂肪酶的活力的手段，利于延长麦胚的贮藏期。

麦胚 脂肪酶 无机盐 蛋白结构 酶活

麦胚是小麦籽粒中营养最丰富的部分之一，富含脂肪、蛋白、矿物质和维生素。但由于其含有高活性脂肪酶与不饱和脂肪酸，极易酸败变质，致使麦胚易风味恶化、酸度上升、营养品质下降[1-2]，严重影响麦胚的精深加工与高效利用。针对这一难题，众多研究者曾采用热风干燥、湿热蒸汽等热处理方式钝化麦胚脂肪酶，由于脂肪酶具有较好的热稳定性，热处理钝酶不彻底；同时，热处理可能引发脂质自动氧化从而引起非酶酸败，降低麦胚的营养价值[3-4]。目前，稳定麦胚的另一种思路是向麦胚中添加脂肪酶抑制剂，其中无机盐作为脂肪酶抑制剂受到众多研究者的青睐[5]。

酶的催化活性与酶结构密切相关，研究无机盐对脂肪酶结构的影响具有重要意义[6]，已有研究证实，无机盐对酶活性的抑制作用是由于无机盐改变了酶的结构造成的[7]。Müller等[8]首次证明了KCl对死海盐盒菌脂肪酶结构的影响。Cheng等[9]研究了CaCl2对铜绿假单胞菌脂肪酶结构的影响，发现Ca2+会改变脂肪酶活性中心精氨酸153和天冬氨酸157残基的电荷，影响活性中心“盖子”的打开与关闭，使脂肪酶由活性构象转变为非活性构象，降低了脂肪酶的活性。目前，关于无机盐对脂肪酶结构影响的研究，多是针对微生物来源的脂肪酶，无机盐对麦胚脂肪酶结构和活性的影响鲜见报道。本研究探讨了不同种类无机盐对商品化麦胚源脂肪酶活力与结构的影响，并在此基础上，分析了无机盐对麦胚中脂肪酶活力以及麦胚酸价的影响，以及无机盐钝化麦胚脂肪酶的可行性，为麦胚稳定化处理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦胚芽脂肪酶(5～15 U/mg蛋白)：美国Sigma公司；三乙酸甘油酯：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；小麦胚芽：新疆天山面粉公司；橄榄油：西班牙muelolivas橄榄油公司。

1.2 仪器与设备

S220精密pH计：瑞士Mettler Toledo公司；877 Titrino plus自动电位滴仪：瑞士Metrohm公司；J-815圆二色光谱仪：日本JASCO公司；Cary Eclipse荧光分光光度计、Cary紫外-可见分光光度计：美国Varian公司；HB43-S型卤素水分快速测定仪：瑞士Mettler Toledo公司；Aqua Lab Series 3水分活度仪：美国Decagon Devices公司；RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 无机盐对商品化麦胚脂肪酶的活力及结构的影响

1.3.1.1 样品预处理

称取500.0 mg商品化麦胚脂肪酶溶于0.1mol/L pH=7.7的Tris-HCl缓冲液，定容至50 mL，配成浓度为10 mg/mL的酶溶液，然后在25 ℃、8 000r/min的条件下离心20 min，取上清液作为脂肪酶贮备液保存于冰箱中。

移取2 mL的10 mg/mL的脂肪酶贮备溶液，加入一定浓度的无机盐标准溶液(用0.1 mol/L pH=7.7的Tris-HCl缓冲液配制不同浓度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2标准溶液)，用0.1 mol/L pH 7.7的Tris-HCl缓冲液定容至10 mL，配成质量浓度为2 mg/mL的无机盐—脂肪酶混合溶液。摇匀后放入25 ℃恒温振荡器振荡20 min，待测。

1.3.1.2 脂肪酶活力测定

参考徐斌等[10]的方法。移取10 mL 0.33 mol/L的三乙酸甘油酯底物溶液(三乙酸甘油酯溶于0.1 mol/L pH=7.7的Tris-HCl缓冲溶液)于25 mL具塞三角锥形瓶中，添加2 mL无机盐—脂肪酶混合溶液；空白组添加2 mL 0.1 mol/L pH 7.7的Tris-HCl缓冲液。置于37 ℃烘箱中反应4 h，反应结束后，将样品置于沸水浴中10 min终止反应，再用冷水冷却样品至室温，进行脂肪酶活力的测定。用0.005 mol/L的H2SO4溶液滴定样品至pH=6.0，由2管所用滴定液之差(ΔVH2SO4)即可计算出麦胚脂肪酶水解三乙酸甘油酯生成的脂肪酸量。按公式计算脂肪酶的活力：

式中：X为脂肪酶的活力/U/mg；A为滴定样品时消耗H2SO4标准溶液的体积/mL；B为滴定空白时消耗H2SO4标准溶液的体积/mL；t为反应的时间；m为0.5mL硫酸中所含的氢离子的物质的量/μmol；n为酶液稀释倍数。

1.3.1.3 脂肪酶的结构测定

用0.1 mol/L pH=7.7的Tris-HCl缓冲溶液将无机盐-脂肪酶混合溶液稀释至0.08 mg/mL，进行光谱分析。

圆二色谱(CD)分析脂肪酶二级结构条件：石英样品池的光程1.0 cm，响应时间0.5 s，扫描速度50 nm/min，带宽2 nm，灵敏度50 mdeg/cm，扫描测定波长范围190～250 nm。

荧光发射光谱分析脂肪酶三级结构条件：激发波长λex=279 nm，激发狭缝和发射狭缝均为5 nm，扫描测定波长范围300～400 nm。

1.3.2 无机盐对麦胚中脂肪酶钝化效果

1.3.2.1 麦胚预处理

称取100 g新鲜麦胚，均匀喷洒10 mL不同浓度无机盐溶液。根据文献报道[11]设置无机盐的添加量(无机盐添加量均以干基计)。NaCl添加量分别为：0.40%、0.70%、1.00%、1.30%，KCl添加量分别为：0.25%、0.50%、0.75%、1.00%。

1.3.2.2 加速贮藏试验

将麦胚装入聚乙烯袋(100 g)，置于40 ℃培养箱贮藏7 d，考察麦胚中脂肪酶活力与酸价的变化。

1.3.2.3 麦胚中脂肪酶活力测定

参考徐斌等[10]的方法。取2支10 mL的离心管，1支是样品管(Af)，另1支是空白对照管(Ai)。分别将2.0 g脱脂麦胚(干基，30目粉碎)和1.5 mL橄榄油装入离心管，混匀。样品管在55 ℃培养箱中反应4 h，用30 mL正己烷分3次萃取反应物，对照管加入30 mL的直接萃取反应物，萃取液减压浓缩溶于4 mL异辛烷，加入2 mL 5%(m/V)醋酸铜(吡啶调至pH=6.1)，振荡、离心取上层有机相，715 nm波长条件下测定吸光度，脂肪酶活力以相对酶活表示。

式中：Y为脂肪酶活动度/U/g；1 000为mol/L到μmol/mL的转换系数；4为重溶油脂的异辛烷的体积/mL；V为加入橄榄油的体积/mL；Af为在715 nm下经过反应的样品的吸光度；Ai为在715nm下空白样品的吸光度；ε为油酸在715 nm下的摩尔吸光系数/(mol·L-1·cm)-1；T为反应时间/h；I为路径长度/cm；s为样品干质量/g。

1.3.2.4 麦胚酸价测定

麦胚油(石油醚提取)溶解在中性乙醚+乙醇(2∶1，V/V)中，用0.05 mol/L的氢氧化钾-乙醇溶液进行滴定，酚酞作为指示剂。

1.3.3 统计分析

采用SPSS 19.0进行数据分析，用95%置信水平(P<0.05)来说明数据间差异显著性。每组试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 无机盐对脂肪酶活性的影响

由图1a可知，NaCl对脂肪酶活性有抑制作用，随着NaCl浓度的增加，脂肪酶活力先减小再增加；NaCl浓度为2×10-9mol/L时，脂肪酶活力最低，酶活力降低了14%；KCl对脂肪酶活性无明显作用；CaCl2、MgCl2对脂肪酶活性有不同程度的激活作用。

研究了相同浓度下4种无机盐对脂肪酶活力的影响，得出NaCl对脂肪酶活力影响最大，所以，进一步缩小范围确定NaCl的最佳浓度。图1b NaCl在1×10-9～8×10-9mol/L浓度范围内，对脂肪酶活性有抑制作用，其中NaCl浓度为4×10-9mol/L时，对脂肪酶的抑制效果最好，此时脂肪酶活力降低了21.8%。

脂肪酶是一种具有界面活性的蛋白质，可通过分子间静电作用吸附在油水界面对甘油三酯进行水解[12-13]，油水界面不仅是脂肪酶反应的场所，也是调控的关键位点。已有研究表明，一定浓度NaCl溶液可以降低油水界面的张力，进而改变界面分子的静电作用影响脂肪酶在油-水界面的吸附，另外甘油三酯水解产生的甘油二酯、游离脂肪酸等均会占据界面层与脂肪酶分子发生竞争，从而影响脂肪酶的水解速率[14]。

图1 无机盐对商品化麦胚脂肪酶活性的影响

而CaCl2和MgCl2对脂肪酶的激活作用可能是2个方面原因：一方面，CaCl2和MgCl2能够与水解后的脂肪酸结合成不溶复合物脂肪酸钙盐，消除了产物的抑制作用[15]；另一方面，可能是由于Ca2+或Mg2+会与脂肪酶催化中心带有负电的Ser-His-Asp“催化三联体”交联，使得脂肪酶的刚性增加，结构更加稳定[16-17]。

2.2 无机盐对脂肪酶二级结构影响

由图2可知，不同浓度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2对脂肪酶的CD光谱均无显著影响，在208和222 nm处α-螺旋的负峰、215 nm处β-折叠的负峰峰位均没有发生移动(蓝或者红移)，脂肪酶的峰高也未明显改变。利用K2D软件计算脂肪酶二级结构含量[17]的结果见表1，脂肪酶肽链中二级结构组成未发生显著变化(P>0.05)：α-螺旋为15%、β-折叠为33%，无规则卷曲为52%。NaCl与KCl改变

图2 无机盐处理后商品化麦胚脂肪酶的CD图谱

表1 无机盐对商品化麦胚脂肪酶二级结构组成的影响

无机盐种类无机盐浓度/(×10-9mol/L)α-螺旋/%β-折叠/%无规则卷曲/%NaCl0153352114335321533524153352814335316143452KCl01533520.1143254115315421432541016305450143155100153154CaCl201533520.1153253115315421433531016325350153253100153352MgCl201533520.1143254116305421630541014335350153352100153253

脂肪酶的活力却未改变脂肪酶的二级结构，推测可能是无机盐影响了脂肪酶活性部位的柔性，而酶活性部位的柔性是酶充分表现活性所必需[18]，但是这种改变未导致二级结构的改变。邹承鲁等[19]研究表明酶活力的变化先于可察觉的构象的变化。

2.3 无机盐对脂肪酶三级结构影响

荧光光谱法是研究溶液中蛋白质分子构象的一种有效的方法[18]，蛋白质的色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸残基被一定波长的光源激发后能发射荧光，扫描得到的Imax和λmax的变化受到发色基团与周围溶液环境的相互作用的影响[19]，因此，荧光光谱的变化可以说明脂肪酶分子的三级结构发生了改变[1]。脂肪酶-盐溶液的λ溶液的红移，表明脂肪酶芳香族氨基酸分子的侧链基团逐渐暴露于溶液中，其所处环境的疏水性降低，脂肪酶三级结构改变[20]。添加NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2后，脂肪酶-盐溶液的λ溶液的发生不同程度的红移，表明无机盐对脂肪酶三级结构产生影响。

为了排除无机盐Tris-HCl缓冲液对荧光测定结果的影响，本研究对未添加脂肪酶的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24种无机盐Tris-HCl缓冲液进行荧光光谱分析。脂肪酶真实的荧光强度(ΔImax)是脂肪酶-盐溶液与无机盐Tris-HCl缓冲液两部分Imax的差值。

表2表明，不同浓度、不同种类的无机盐对脂肪酶结构的影响不同。脂肪酶-NaCl溶液的ΔImax下降，推测NaCl使脂肪酶肽链伸展度增加，部分芳香族氨基酸残基暴露到分子表面与极性溶液接触后其发出的荧光被极性环境淬灭[7，20]，表明NaCl改变了脂肪酶周围结合水的状态破坏了蛋白质的水合层，使脂肪酶分子的水化半径的增加[21]。脂肪酶-KCl溶液、脂肪酶-CaCl2溶液和脂肪酶-MgCl2溶液的ΔImax增加，表明脂肪酶分子中生色基团周围环境的疏水性增强酶与底物亲和力增强，而疏水相互作用在很大程度上影响了脂肪酶的构象。

由图3a可知，随着NaCl浓度的增加，脂肪酶的ΔImax先降低后增加，NaCl浓度为4×10-9mol/L时脂肪酶的ΔImax最低。由图3b可知，随着KCl、CaCl2、MgCl2浓度的增加，脂肪酶的ΔImax增加呈上升趋势，与本研究中的4种无机盐对脂肪酶活性的影响规律一致，可见脂肪酶活力大小与荧光强度呈正相关，通过ΔImax的变化可预测脂肪酶活力的变化。因此，NaCl、KCl、CaCl2和MgCl24种无机盐使脂肪酶的三级结构发生了改变。

综合考虑无机盐对胚芽来源的脂肪酶活性，结构等影响因素，本试验选取NaCl、KCl为添加无机盐，研究其对小麦胚芽中脂肪酶活性的影响。

2.4 无机盐对麦胚中脂肪酶活力的影响

长期以来，研究者尝试各种手段钝化麦胚中脂肪酶的活性，来实现麦胚的稳定化[22]。已有研究证实，向谷物、油料种子中添加无机盐可以有效抑制脂肪酶活力，该法成本低、不易引发脂质自动氧化，能够有效保留原料的营养价值[23-24]。目前，国外研究者开展了无机盐对小麦、麸皮等物料中脂肪酶活力与物料品质影响的研究，本试验也就NaCl、KCl对麦胚中脂肪酶活力的影响进行了探究。由图4可知，随着NaCl、KCl添加量的增加，脂肪酶活力显著下降(P<0.05)，1.30%的NaCl使脂肪酶活力降低了62.49%，0.75% KCl使脂肪酶活力降低了61.27%，有利于延长麦胚的贮藏期，这与前人研究一致[2，4]。

表2 无机盐对商品化麦胚脂肪酶荧光特性的影响

图3 无机盐对商品化麦胚脂肪酶荧光强度的影响

图4 无机盐对麦胚脂肪酶活力的影响

图5 无机盐对麦胚酸价的影响

2.5 无机盐对麦胚酸价的影响

由图5可知，未添加无机盐的麦胚酸价为14.20 mgKOH/g，添加一定比例的NaCl和KCl均会对麦胚酸败具有一定的抑制作用，这可能是因为无机盐对麦胚中脂肪酶的活性产生了抑制作用，从而降低了麦胚的酸败速率，这与前人研究结果一致[2，4]。综上，向麦胚中添加1.30%的NaCl和0.75%的KCl，既能延缓麦胚酸败，又可以被消费者接受。

3 结论

NaCl对商品化麦胚脂肪酶活力有抑制作用，使酶活力降低了21.8%，可作为麦胚脂肪酶的有效抑制剂；而KCl、CaCl2和MgCl2对商品化麦胚脂肪酶的活力无明显影响。对于麦胚中的脂肪酶，添加1.30%的NaCl和0.75%的KCl可以使得麦胚脂肪酶活力与酸价显著降低，其中NaCl延缓麦胚酸败的能力强于KCl，NaCl对麦胚中脂肪酶有显著抑制作用。因此，向麦胚中添加NaCl可以作为延长麦胚贮藏期的一种有效手段。

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Effect of Inorganic Salt on the Activity of Wheat Germ Lipase

Chen Zhongwei Wang Keke Liu Yanxia Xu Bin

(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University;Institute of Agriculture Products Process Engineering，Zhenjiang 212013)

To exploit a new method to stabilize wheat germ，the structure of wheat germ lipase were analyzed after adding inorganic salt using circular dichroism and fluorescence spectrum.Moreover，the activity of lipase in wheat germ and the acid-value of germ were also studied after adding different inorganic salt.The results showed that when the content of NaCl was 4×10-9mol/L，the activity of lipase decreased by 21.8%，while KCl had no significant effect on the activity of wheat germ lipase.However，the activity of wheat germ lipase increased after adding CaCl2and MgCl2.After adding salts，the secondary structure of the lipase was not changed，while the tertiary structure of the lipase was changed after adding NaCl.Compared to the wheat germ without adding inorganic salt，the activity of the lipase in wheat germ and acid-value of the wheat germ decreased，the content of NaCl was 1.3% and KCl was 0.75%，the activity of lipase decreased 62.49% and 61.27%.Therefore，adding salt could be used to inhibit the activity of wheat germ lipase and extend the storage period of wheat germ.

wheat germ，lipase，inorganic salt，structure，enzyme activity

国家自然科学基金面上项目(31371877)，国家博士后基金特别资助(2013T60510)

2015-11-16

陈中伟，男，1985年出生，讲师，粮油深加工

徐斌，男，1969年出生，教授，粮油深加工

TS-3

A

1003-0174(2017)06-0008-07