刘 宇，雷泽华△，杜 波，王志旭，高峰畏，王 清，张建新

(1.四川省乐山市人民医院普外科 614000；2.江苏大学附属医院，江苏镇江 212001)

论著·基础研究

TLR9对胰腺癌裸鼠增殖生长及化疗耐药性的研究

刘 宇1，雷泽华1△，杜 波1，王志旭1，高峰畏1，王 清1，张建新2

(1.四川省乐山市人民医院普外科 614000；2.江苏大学附属医院，江苏镇江 212001)

目的 观察TLR9在不同的活化状态下对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长及药物抗性的影响。方法 建立人胰腺癌PANC-1细胞裸鼠移植肿瘤模型，并随机分为6组：无菌生理盐水组、TLR9激动剂、TLR9抑制剂组、吉西它滨组、TLR9抑制剂+吉西它滨组、TLR9激动剂+吉西它滨组进行实验。游标卡尺记录肿瘤体积大小及生长情况，采用免疫组化方法检测肿瘤TLR9受体表达情况，核磁共振成像(MRI)观察肿瘤生长、转移及周围组织侵犯情况。结果 吉西他滨组、TLR9激动剂+吉西它滨组、TLR9抑制剂+吉西它滨组肿瘤摘除后体积及生长速度明显小于其他组(P<0.05)，TLR9激动剂+吉西它滨组生长速度及肿瘤摘除后体积明显大于TLR9抑制剂+吉西它滨组及吉西他滨组(P<0.05)，TLR9抑制剂+吉西它滨组与吉西他滨组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，TLR9激动剂组、TLR9抑制剂组及生理盐水组差异无统计学意义(P>0.05)。种植后7周小鼠在MRI下观察，瘤成椭圆形，境界清楚，周围组织未见明显转移及对周围组织的侵犯；检测肿瘤组织中并鉴定表面明确有TLR9的表达。结论 胰腺癌裸鼠移植瘤中确有TLR9的阳性表达，TLR9的激活可以明显降低胰腺癌对吉西他滨化疗的敏感性，增加肿瘤的耐药性，相反促进肿瘤生长。

胰腺肿瘤；裸鼠；吉西他滨；TLR9

胰腺癌是一种临床常见消化道恶性肿瘤，据最新流行病学统计，美国每年有45 220例新发现的胰腺癌病例，同时有38 460例胰腺癌的患者死亡，而世界范围内的胰腺癌年发病的病例达277 668例，年死亡病例达266 029例[1]。胰腺癌虽然不是高发病例，但由于其发病隐匿，恶性程度高，手术切除率低等原因，发病率与病死率相近[2]。目前国内外惟一公认对胰腺癌有化疗作用的吉西他滨，也随着胰腺癌化疗耐药性的增加，治疗效果逐渐降低，所以探寻降低胰腺癌对吉西他滨的耐药性成为研究提高治疗胰腺癌效果的方向。近年来有研究表明，胰腺癌中存在TLR9表达，且TLR9的表达及活化水平与肿瘤细胞生长情况呈正相关[3]。但尚未见在不同的活化状态下TLR9对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长及药物耐药性的影响的相关试验研究，尤其是动物体内试验。

本研究通过吉西他滨、TLR9激动剂OND1826及抑制剂0ND2088干预，观察TLR9在不同的活化状态下人胰腺癌裸鼠移植瘤生长、转移以及对周围组织的侵犯情况，并研究其对胰腺癌的吉西他滨耐药性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 胰腺癌PANC-1细胞由上海中山医院实验中心惠赠，BALB /c裸鼠3～5周龄，体质量18～21 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[动物许可证编号:SCXK(沪)2007-0005]，饲养于江苏大学实验动物中心屏障环境(SPF级)，DMEM培养基、胎牛血清购、青链双抗购自Gibco公司，ODN1826(Invivogen公司)、ODN2088(Invivogen公司)，吉西他滨购于礼来公司，TLR-9(SANTA CRUZ公司)，HRP标记的羊抗兔IgG抗体(SANTA CRUZ公司)，核磁共振仪由江苏大学附属医院放射科提供。

1.2 人胰腺癌荷瘤鼠模型的建立 培养PANC-1细胞至对数生长期后，收集细胞并用PBS液调整细胞悬液浓度至1×108个/mL。随机选取5只裸鼠，碘伏消毒裸鼠右侧前腋下皮肤，每只裸鼠皮下注射0.2 mL细胞悬液( 2×107个细胞) 。接种5 d左右后可见接种部位皮下长出豌豆大小硬结，10 d时皮下移植瘤长成约0.7 cm×0.8 cm×0.8 cm，约3周后颈椎脱臼法处死裸鼠。处死裸鼠后，摘除肿瘤后用PBS冲洗，修剪肿瘤块大小约1 mm3左右，随机选择40只裸鼠，用显微外科镊子夹取肿瘤块于接种针头内(20#腹穿针)，接种于裸鼠右侧前腋皮下，以皮下肿瘤结节长至出现0.5 mm×0.5 mm硬结，变成肉色为标准，10 d左右成瘤[4]，成瘤率97.5%。

1.3 实验分组及给药干预 当右侧前腋下皮下肿瘤结节长至出现0.5 mm×0.5 mm硬结，成肉色时。随机于39只成瘤老鼠中选取36只分成6组：无菌生理盐水组(腹腔注射生理盐水)、TLR9激动剂组(腹腔注射)、TLR9抑制剂组(腹腔注射)、吉西它滨组(生理盐水稀释后以25 mg/kg,3天/次,共4次)、TLR9激动剂+吉西它滨组(给予吉西他滨25 mg/kg,3天/次,共4次，吉西它滨最后1次给药后4 d开始腹腔注射TLR9激动剂,7天/次,共6次)、TLR9抑制剂+吉西它滨组(给予吉西他滨25 mg/kg，3天/次，共4次,吉西它滨最后一次给药后4 d开始腹腔注射TLR9抑制剂，7天/次，共6次)进行实验。

1.4 肿瘤生长情况观察 36只裸鼠完成实验,未出现意外死亡，分组后给药干预，以游标卡尺每隔4 d记录肿瘤大小，肿瘤体积(mm3)=1/2×AB2(A、B 分别为经过中心点的肿瘤最大径和最小径)[5]，绘制肿瘤生长曲线，观察结束后小鼠用于MRI成像，而后以颈椎脱臼法处死，摘除肿块甲醛固定，用于病理学检测。

1.5 MRI了解肿瘤对周围组织的侵袭及转移情况 将小鼠带于江苏大学附属医院放射科，盐酸氯氨酮腹腔注射麻醉后，于小鼠固定器上给予MRI的拍摄，观察对周围组织的侵犯及转移情况。

1.6 检测裸鼠皮下胰腺癌移植瘤组织中TLR9的表达:取下各组裸鼠胰腺癌瘤块后以4%福尔马林固定，石蜡包埋，取生理盐水组肿瘤作TLR-9免疫组织化学染色，显微镜下观察，拍片。

2 结 果

2.1 一般情况 裸鼠予皮下种瘤后，各组小鼠生长良好，未出现死亡，给药干预后，各组老鼠无特殊异常，正常进食，活动好。

2.2 腺癌裸鼠皮下肿瘤体积 当肿瘤生长约豌豆大小硬结，各组给药干预，游标卡尺测量肿瘤生长情况，最后1次给药7 d后瘤块大小见图1。吉西他滨组、TLR9激动剂+吉西它滨组、TLR9抑制剂+吉西它滨组肿瘤块体积明显较其他组小(P<0.05)，TLR9激动剂+吉西它滨组体积(814.56±529.70)mm3比TLR9抑制剂+吉西它滨组体积(301.48±109.51)mm3及吉西他滨组(561.06±277.43)mm3肿瘤块大(P<0.05)，TLR9抑制剂+吉西它滨组与吉西他滨组比较(P<0.05)；TLR9激动剂组、TLR9抑制剂组及生理盐水组肿瘤大小差异无统计学意义(P>0.05)。

A:无菌生理盐水组;B:TLR9激动剂组;C:TLR9抑制剂组;D:吉西它滨组;E:TLR9激动剂+吉西它滨组;F:TLR9抑制剂+吉西它滨组。

图1 各组胰腺癌肿瘤摘除后比较

2.3 人胰腺癌裸鼠皮下肿瘤模型生长情况 可见给药干预以后，TLR9激动剂+吉西它滨组及TLR9抑制剂+吉西它滨组明显较对照组生理盐水组的生长速度减慢，见图2。TLR9激动剂+吉西它滨组及TLR9抑制剂+吉西它滨组差异无统计学意义(P>0.05)，TLR9抑制剂+吉西它滨组的生长速度也较TLR9激动剂+吉西它滨组减慢。

A:无菌生理盐水组;B:TLR9激动剂组;C:TLR9抑制剂组;D:吉西它滨组;E:TLR9激动剂+吉西它滨组;F:TLR9抑制剂+吉西它滨组。

图2 各组小鼠肿瘤生长曲线

2.4 MRI了解肿瘤对周围组织的侵袭及转移情况 分别选取各组7周肿瘤老鼠在MRI下观察，可见7周肿瘤成椭圆形，境界清楚，周围组织未见明显转移，肝肾未见明显转移，见图3。

A:无菌生理盐水组;B:TLR9激动剂组;C:TLR9抑制剂组;D:吉西它滨组;E:TLR9激动剂+吉西它滨组;F:TLR9抑制剂+吉西它滨组。

图3 各组裸鼠在MIR下的影像观察

2.5 各组裸鼠处死后摘除肿瘤体质量、体积及抑瘤率 生理盐水组、TLR9激动剂组、TLR9抑制剂组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，吉西他滨组的抑瘤率为77.9%，吉西它滨+TLR9激动剂组抑瘤率为66.7%，吉西它滨+TLR9抑制剂组抑瘤率为87.7%，见表1。

表1 各组肿瘤生长抑制作用比较

2.6 肿瘤组织表面TLR9的表达检测 免疫组化结果显示胰腺癌组织TLR9表达阳性，成棕黄色，主要位于细胞质及细胞间质，见图4。

图4 裸鼠胰腺癌组织TLR9表达(×400)

3 讨 论

胰腺癌是人常见的恶性肿瘤，近20年我国的发病率有增加的趋势，已从第16位跃升至第6位，其发病隐匿，恶性程度高，手术切除率低，预后极差[6]。对于胰腺癌患者，目前治愈的惟一方法是手术切除，但是胰腺癌局部的浸润，强烈的结缔组织增生反应常会累及周围重要的脏器，减少这些肿瘤完整切除的机会[7]。大多数患者确诊时局部已不能手术或已有远处转移，只有20%～30%的患者可以接受手术切除。即使在这部分手术的患者中，肿瘤复发率很高，5年生存率只有15%～20%[8]，中位生存时间15～19个月。目前的许多方法如化疗、放疗、酶抑制剂等对于治疗胰腺癌效果不佳。因此，基因治疗胰腺癌始终是这一领域的焦点。有研究结果表明Toll样受体和TLR9诱导及其信号转导通路在肿瘤的发展中发挥了重要作用[9]；有学者已指出TLR9在胰腺癌组织、胰腺癌旁组织及正常胰腺癌组织都有表达，且在胰腺癌中表达最多，癌旁组织次之，正常胰腺组织最少[10]；发现TLR9与胰腺癌增殖、侵袭、转移有密切联系，通过本实验研究发现它还与胰腺癌耐药有关，未来在临床治疗中，TLR9的研究可能可以为肿瘤的化疗和免疫治疗提供新的治疗方案。

吉西他滨是目前公认的胰腺癌抗肿瘤药物,其机理为药物进入细胞后代谢成为有活性的二磷酸盐和三磷酸盐,并在细胞内聚集,竞争性掺入DNA双键,从而抑制肿瘤细胞的DNA合成。即便如此，单独静脉使用吉西他滨仍然效果有限。最新报道单独静脉使用吉西他滨的临床受益率为23.8 %,中位生存期5.7个月,6个月累积生存率46%,9个月累积生存率24%,中位疾病进展时间2.1个月[11]。这一现象提示胰腺肿瘤细胞对抗癌药物具有耐药性。

作者前期体外试验中已证实TLR9的激活可以增加胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药。为进一步证明TLR9对胰腺癌的化疗耐药性影响，本研究中通过建立裸鼠胰腺癌肿瘤模型，并观察记录分析肿瘤生长情况。本研究结果显示，吉西他滨组、TLR9激动剂+吉西它滨组、TLR9抑制剂+吉西它滨组肿瘤体积及生长速度明显小于其他组(P<0.05)；TLR9激动剂+吉西它滨组生长速度及体积明显大于TLR9抑制剂+吉西它滨组及吉西他滨组(P<0.05)；TLR9抑制剂+吉西它滨组与吉西他滨组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；TLR9激动剂组、TLR9抑制剂组及生理盐水组差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学显示移植瘤中有明显TLR-9表达，主要位于细胞质及间质中，MRI观察显示肿瘤种植7周后，肿瘤周围组织及血管未见明显侵犯。上述结果提示，TLR-9受体的活化可增加胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药作用，降低胰腺癌对化疗的敏感性，促进肿瘤生长，相关则抑制生长。

综上所述，TLR-9的激活可以明显增加胰腺癌细胞对化疗的耐药性，降低其对吉西他滨诱导的凋亡的敏感性。但胰腺癌中TLR-9受体所介导的化疗耐药性机制仍不明，有待进一步研究。

[1]Mantoni TS,Lunardi S,Al-Assar O,et al.Pancreatic stellate cells radioprotect pancreatic cancer cells through β1-integrin signaling[J].Cancer Res,2011,71(10):3453-3458.

[2]Wu HQ,Wang B,Zhu SK,et al.Effects of CPG ODN on biological behavior of PANC-1 and expression of TLR9 in pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol,2011,17(8):996-1003.

[3]Shankar S,Marsh L,Srivastava RK.EGCG inhibits growth of human pancreatic tumors orthotopically implanted in Balb C nude mice through modulation of FKHRL1/FOXO3a and neuropilin[J].Mol Cell Biochem,2013,372(1/2):83-94.

[4]Tanahashi K,Natsume A,Ohka F,et al.Assessment of tumor cells in a mouse model of diffuse infiltrative glioma by Raman spectroscopy[J].Biomed Res Int,2014(2):860241.

[5]Philips P,Li Y,Martin RC.Low-energy DC current ablation in a mouse tumor model[J].Methods Mol Biol,2014,1121(1121):257-265.

[6]Lepage C,Capocaccia R,Hackl M,et al.Survival in patients with primary liver cancer,gallbladder and extrahepatic biliary tract cancer and pancreatic cancer in Europe 1999-2007:results of EUROCARE-5[J].Eur J Cancer,2015,51(51):2169-2178.

[7]卢旷逸，范昕，马小艳，等．TLR9激动剂在胰腺星状细胞介导的胰腺癌耐药中的作用[J]．江苏大学学报(医学版)，2012，22(3)：223-226．

[8]孙运良，徐灿，苏长青，等．靶向重组腺病毒介导 Hsp70 基因表达对大鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用[J]．世界华人消化杂志，2012，20(1)：15-21．

[9]Wu HQ,Wang B,Zhu SK,et al.Effects of CPG ODN on biological behavior of PANC-1 and expression of TLR9 in pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol,2011,17(8):996-1003.

[10]Zambirinis CP,Levie E,Nguy S,et al.TLR9 ligation in pancreatic stellate cells promotes tumorigenesis[J].J Exp Med,2015,212(12):2077-2094.

[11]Bruckner H.Phase Ⅰ and Ⅱ studies of intravenous Rexin-G as monotherapy for stage Ⅳb gemcitabine-resistant pancreatic cancer[J].Br J Surg,2014,63(2):162-165.

Research on influence of TLR9 on pancreatic cancer nude mouse model growth and resistance to chemotherapy*

LiuYu1,LeiZehua1△,DuBo1,WangZhixu1,GaoFengwei1,WangQing1,ZhangJianxin2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,LeshanMunicipalPeople′sHospital,Leshan,Sichuan614000，China；2.AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

Objective To observe the effects of TLR9 on the nude mouse transplanted tumor growth of human pancreatic cancer and its drug resistance.Methods The nude mouse transplated tumor of human pancreatic cancer PANC-1 was established and randomly divided into 6 groups for conducting the experiment:sterile normal saline group,TLR9 agonist,TLR9 inhibitor group,gemcitabine group,TLR9 inhibitor plus gemcitabine Bin group,TLR9 agonist plus gemcitabine.The tumor size and growth situation were recorded by the vernier caliper.The immunohistochemical method was used to detect tumor TLR9 receptor expression.The tumor growth,metastasis and paracancerous tissue invasion situation were observed by the magnetic resonance imaging (MRI).Results The volume and growth speed of resected tumor mass in the gemcitabine group,TLR9 agonist + gemcitabine group,TLR9 inhibitor plus gemcitabine group was significantly smaller than those in other groups (P<0.05),which in the TLR9 agonist + gemcitabine group were significantly greater than those in the TLR9 inhibitor plus gemcitabine group and gemcitabine group (P<0.05),the difference between the TLR9 inhibitor plus gemcitabine group and gemcitabine group had statistical significance (P<0.05),while the difference among the TLR9 agonist group,TLR9 inhibitor group and normal saline group had no stastistical significance (P>0.05).The tumor in mice at 7 weeks after planting showed oval shape with clear boundary by MRI observation,no obvious metastais and paracancerous invasion were seen in paracancerous tissues no statistically significant,5 weeks,6 weeks after planting,seven weeks mice observed in MRI,the tumor into an,state clearly that the transfer of the surrounding tissue,no significant vascular invasion,heart,liver,kidney disease.The TLR9 expression on the surface of tumor tissue was detected and identified.Conclusion Pancreatic cancer nude mouse transplated tumor has definitely positive expression of TLR9,TLR9 activation can significantly decrease the sensitivity of pancreatic cancer to chemotherapy,increases the drug resistance of tumor,on contrary promotes the tumor growth.

pancreatic neoplasms;nude mouse;gemcitabine;TLR9

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.003

国家自然科学基金资助项目(81070287)。作者简介：刘宇(1986-)，硕士，医师，主要从事肝胆外科工作。△

，E-mail：leitsehua@126.com。

R735.9

A

1671-8348(2017)16-2167-03

2017-01-14

2017-03-18)