王洪，罗惠波，2*，廖玉琴，邓露，刘蔺，罗广

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

多粮生料酿酒工艺的研究

王洪1，罗惠波1，2*，廖玉琴1，邓露1，刘蔺1，罗广1

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

以生料曲为糖化发酵剂，大米、玉米、高粱为原料混合发酵进行生料酒的酿制。研究了发酵温度、pH、水料比、加曲量对出酒率的影响。通过单因素和正交试验，得到最优工艺参数为大米∶玉米∶高粱=6∶1∶3，发酵温度31℃，pH 5.5，水料比2.5∶1，加曲量1%，在此条件下，出酒率为75.0%（55°计）。

生料酿酒；多粮；工艺优化；正交试验

生料酿酒技术的研究始于日本，由于种种原因发展缓慢，我国开始于20世纪70年代末，发展迅速，到80年代达到高潮。生料酿酒免去了传统酿酒时对粮食和辅料的蒸煮、上甑、摊晾等繁琐工序，并且因能节约能源、提高劳动效率、提高出酒率、操作简单、可进行工业化生产而受到国内外酿酒企业的青睐。目前，生料酿酒工艺主要分为固态法和液态法，但液态法是主流形式[1]；用于生料酿酒的粮食来源广泛，主要包括大米、玉米、高粱、小麦、红薯等[2-5]，酿酒行业有“高粱酿酒香、玉米酿酒甜、小麦酿酒冲、大米酿酒净、糯米酿酒浓”的说法；生料发酵技术不仅广泛用于白酒、黄酒、清酒的生产[6]，而且也用于食醋、单细胞蛋白饲料、生料甜酒曲的制备[7-9]，蒸馏剩余酒糟因富含营养物质也可回收利用作为饲料、酿醋等[10]；但由于生料酒香气单一，口感单薄不协调，为大规模推广带来困难。目前大多数生料酒厂使用单一的粮食酿酒，由于其物质营养成分单一，微生物代谢产物少，使得酒质较差。本试验通过大米、玉米、高粱混合用于生料酿酒，以期提高酒香，使酒体口感醇和协调，并通过优化其工艺，提高出酒率，为工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米、玉米、高粱：市售；生料曲：丽水力克生物科技有限公司；乙酸、乙酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

不同pH缓冲溶液的配制：参照国标GB/T 603—2002《化学试剂标准滴定溶液的制备》配制，用pH计校正。

1.2 仪器与设备

ZWYR-D2403型恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；STARTER2100型实验室pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司；800Y型多功能粉碎机：铂欧五金厂；Alcomat Super酒精度测试仪：意大利盖博分析仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 粮食配比

大米粉碎过40目筛，玉米粉碎过60目筛，高粱粉碎过100目筛，将总粮为50 g的三种粮食的不同配比组合（大米∶玉米∶高粱，每种粮食至少要占一份，所占份额为整数，且三种粮食所占份额总和为10，如1∶1∶8，2∶1∶7等）加入三角瓶中，在水料比3∶1（mL∶g）、介质pH4、加曲量0.7%、温度30℃条件下摇床发酵8 d，每天混匀（170 r/min，15 s）3次，测定最终出酒率，并筛选出酒率最高的一组粮食配比，用于后面的发酵试验。

1.3.2 多粮生料酿酒的单因素试验

将50g总粮加入三角瓶中，控制发酵温度30℃，加曲量0.7%，水料比3∶1，在pH值分别为3、4、5、6、7条件下摇床发酵8 d，每天混匀（170 r/min、15 s）3次（下同），得到出酒率的变化情况；控制加曲量0.7%，pH4，水料比3∶1，在发酵温度为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃条件下发酵8 d，得到出酒率的变化情况；控制水料比3∶1，pH4，温度30℃，在加曲量分别为0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%条件下发酵8 d，得到出酒率的变化情况；控制发酵温度30℃，pH4，加曲量0.7%，在水料比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1条件下发酵8 d，得到出酒率的变化情况。

1.3.3 多粮生料酿酒工艺的优化

在单因素试验的基础上，得到发酵温度、加曲量、pH、水料比与出酒率的关系，每天摇床混匀（170 r/min、15 s）3次，发酵8 d。采用4因素4水平的正交试验，以出酒率为指标，以期得到最优的发酵工艺参数。正交试验的因素和水平见表1。

表1 多粮生料酿酒发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of liquor-making with uncooked multiple-grains

1.3.4 测定方法

醪液酒精度的测定：按照参考文献[11]的方法测定；发酵液pH的测定：pH计测定。原料出酒率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 粮食的最佳配比

粮食是微生物主要的碳源、氮源、营养源等物质来源，提供微生物生长、繁殖、代谢所需。不同种类粮食的淀粉、微量元素等含量不同，最终导致出酒率也不一样。不同粮食配比的出酒率如图1所示。

由图1可知，随着混合粮食中大米比例的增加，出酒率也随着增加，当到达最高点后又缓慢下降，当配比为大米∶玉米∶高粱=6∶2∶2时出酒率最高为71.7%；在大米份额相同时随着高粱份额的减少，出酒率有增大的趋势，说明高粱在微环境中对微生物代谢有一定负影响，可能是高粱壳中色素和单宁对微生物有一定的抑制作用；但在配比为6∶2∶2时所得酒生玉米味过重，影响了整体感官，所以取出酒率次高的粮食组合，此时出酒率为71.6%，配比为6∶1∶3，此时粮香优雅，口感舒适。因此以大米∶玉米∶高粱=6∶1∶3进行后续试验。

图1 粮食配比对出酒率的影响Fig.1 Effect of grains ratio on liquor yield

2.2 单因素试验

2.2.1 介质pH对出酒率的影响

介质pH影响糖化酶酶解效率和酵母菌的代谢，发酵体系中适合的pH环境能较好的平衡糖化、酒化、酯化等生化反应，使得生料酒香气浓郁，口感协调，出酒率高。介质pH对出酒率的影响如图2所示。

图2 介质pH对出酒率的影响Fig.2 Effect of pH on liquor yield

由图2可知，出酒率在pH为3～5时，随着pH值的增大而增加，且增加显著（P＜0.05），在pH值为5时达到最大值，此时出酒率为71.2%；当pH＞5时，出酒率随着pH值的增加而缓慢降低，最低点出酒率为68.6%；因此选择最佳pH值为5。不同于先前研究者[3]得到的最佳pH值为4，可能是由于本试验用的生料曲不同，该曲中的糖化酶能在pH=5时也能和其他酶系和酵母菌有较好的协同作用；并且发酵底物为混合粮食，不同于单一的粮食发酵，混粮可为酵母菌提供更为丰富的营养物质及前体物质，有助于酵母的生长、代谢；若生料酿酒能在相对高的pH环境下进行，将更容易进行工业化生产，因为这样可以减少发酵罐的酸腐蚀损失，但为了防止发酵过程中杂菌污染可在发酵前期添加一定量的抑菌剂[12]。

2.2.2 发酵温度对出酒率的影响

发酵温度对酵母的影响较大，适宜的发酵温度能提高酵母的代谢能力，提高出酒率和增加酯类物质的含量；发酵温度对出酒率的影响如图3所示。

图3 发酵温度对出酒率的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on liquor yield

由图3可知，出酒率在发酵温度为28～30℃时，随着温度的升高而显著增加（P＜0.05），到达30℃时取得最大值，出酒率为71.4%，当发酵温度高于30℃时，出酒率随着发酵温度的增加而减少，且在32～34℃时差异不显著，但当温度高于34℃时出酒率显著下降（P＞0.05），说明此时已经开始不适合酵母菌的代谢生长；因此选择最佳发酵温度为30℃。醪液的颜色也随着发酵温度的升高逐渐加深，可能是高粱壳中的色素和单宁大量的溶于发酵液中[13]，一定量的单宁和色素能抑制酵母的生长，这也是酵母菌不适合生长代谢的原因之一。

2.2.3 加曲量对出酒率的影响

加曲量的多少可以改变发酵速度和效率，在一定范围内，随着曲量的增加发酵速度和出酒率也相应提升；加曲量对出酒率的影响如图4所示。

由图4可知，当加曲量为0.5%～0.9%时，出酒率随着加曲量的增大而显著增加（P＜0.05），这是因为当加曲量很少时，发酵体系中的酶系和酵母浓度小，不能充分糖化底物发酵产乙醇，致使出酒率低。当加曲量为0.9%时达到最大值为71.3%，当加曲量＞0.9%时，出酒率随着加曲量的增大而显著减小，这是因为曲量加大后，高浓度的酶吸附在淀粉颗粒上会改变其分子结构，使后续利用困难，最终导致出酒率下降。因此选择最佳加曲量为0.9%。

图4 加曲量对出酒率的影响Fig.4 Effect of starter addition on liquor yield

2.2.4 水料比对出酒率的影响

水料比决定着发酵液中淀粉的浓度，对出酒率也有一定的影响。水料比对出酒率的影响如图5所示。

图5 水料比对出酒率的影响Fig.5 Effect of water-material ratio on liquor yield

由图5可知，当水料比为2∶1～3∶1时，出酒率随着水料比的增大而显著增加（P＜0.05），当水料比为时3∶1时达到最佳出酒率，为72.1%。但当水料比＞3∶1时，出酒率随着水料比的增大而急剧减少，当水料比为6∶1时出酒率达到最低为65.5%。因此选择最佳水料比为3∶1。在先前的一些研究中，生料酿酒水料比一般为3∶1，但根据粮食种类、粮食粒度、发酵工艺不同，会导致相应的水料比的不同[14-16]。

2.3 正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，以加曲量、pH、水料比、温度为因素，以出酒率为考察指标，进行4因素4水平正交试验，结果见表2。

由表2可知，正交试验所得出酒率最高的最佳组合为A4B4C1D3E2，此时出酒率为74.1%，而从加曲量、pH、水料比、温度这4个因素的平均出酒率可得优化组合为A4B4C1D3E3，通过试验得到其出酒率为75.0%，即最优组合为加曲量1%，pH5.5，水料比2.5∶1，温度31℃；由各因素的极差可知，对出酒率的影响大小为水料比＞pH＞加曲量＞发酵温度。

表2 发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，水料比（2.5∶1～4∶1）对出酒率影响极显著（P＜0.01），说明水料比比其他3个因素对出酒率影响更大，发酵温度（29～32℃）对出酒率的影响不显著（P＞0.05），加曲量和pH对出酒率影响显著（0.01＜P＜0.05）。由此可知，在多粮生料酿酒中应多关注水料比，但也不能忽略其他因素的影响，只有协调好4个因素才能得到好品质的酒和较高的出酒率。

3 结论

生料酿酒具有广阔的前景，其中多粮混合发酵为提高酒的风味和出酒率提供了一条思路，通过正交试验得到的最优工艺参数为发酵温度31℃，pH5.5，水料比2.5∶1，加曲量1%，在此条件下出酒率为75.0%。此优化条件下更容易进行高密度的工业化生产，提高出酒率，且能减少发酵罐的酸腐蚀损失，延长使用寿命，节约成本；若能像啤酒那样进行全机械化全控发酵，将会得到品质更稳定，成本更低的生料酒。但由于发酵环境pH较高，要严格控制杂菌的污染。

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Research on the liquor-making technology with uncooked multiple-grains

WANG Hong1,LUO Huibo1,2*,LIAO Yuqin1,DENG Lu1,LIU Lin1,LUO Guang1
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 2.Liquor Making Bio-Technology&Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China)

UsingQumade by uncooked materials as saccharification and fermentation starter,Baijiuwas produced with the uncooked materials of rice,corn and sorghum.The effects of fermentation temperature,pH,water-material ratio and starter addition on liquor yield were researched.By single factor and orthogonal tests the optimum technology parameters were obtained as followed:rice∶corn∶sorghum 6∶1∶3,fermentation temperature 31℃, pH 5.5,water-material ratio 2.5∶1,starter addition 1%.Under the conditions,liquor yield was 75.0%(55°).

liquor-making with uncooked materials;multiple-grains;technology optimization;orthogonal test

TS261.4

0254-5071（2017）06-0038-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.008

2017-02-16

四川理工学院研究生创新基金项目（y2016003）

王洪（1991-），男，硕士研究生，研究方向为酿酒生物技术及应用。

*通讯作者：罗惠波（1969-），男，教授，硕士，研究方向为酿酒生物技术及应用。